文 | 清墨史纪

编辑 | 清墨史纪

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石榴是一种耐盐植物，广泛生长在干旱和半干旱地区，那里总是遭受土壤盐碱化，Bhantana等人报告说，石榴可以用作落叶果树的模型植物，以研究对环境胁迫的反应。

在我们之前的研究中，我们发现Cl−石榴组织中Na含量是Na含量的3倍，其他阴离子的摄取也受到不同浓度盐度的影响。

氯是植物必需的微量营养素，主要以Cl+−。它主要参与植物生理活动，如光合作用、气孔开闭调节、膜电位稳定、细胞内pH梯度调节和电兴奋性。

过量和/或缺乏氯−导致植物生长弱，产量低，质量差。 在盐碱化环境中，主要由高NaCl引起，部分植物的叶面盐害主要由Na引起，而其他植物的叶面盐害。

如*草烟**，葡萄，柑橘和大豆主要由Cl+−.以前的研究报道了阴离子的积累模式，如Cl−不3−，HCO3−，以及42−在植物组织中与植物耐盐性有关。

没有3−-C.−甚至等于K/Na，K/Na被证实是植物耐盐性的关键决定因素之一，研究Cl吸收与转运之间的下导机制++−等阴离子在石榴组织中和盐度条件下有助于阐明石榴的耐盐性。

一、CLC蛋白对生物和/或非生物胁迫的作用

氯通道蛋白与这些阴离子的摄取和运输高度相关，如Cl−不3−，HCO3−我−和Br− 。第一个CLC家族基因是从海洋射线的电器官中鉴定出来的。

从那时起，在细菌，酵母，哺乳动物和植物中发现了一些新成员，在陆地植物中，第一个CLC基因CLC-Nt1在*草烟**中克隆。

随后，从拟南芥、水稻、大豆和三叶橙等中分离出许多CLC基因同系物。所有CLC蛋白都有一个高度保守的电压门控氯化物通道结构域和两个具有假定调节功能的CBS结构域。

此外， CLC基因家族成员包含三个与阴离子选择性相关的高度保守区域：GxGIPE、GKxGPxxH和PxxGxLF。

如果保守区中的x残基是P，则NO3−优先运输，而如果被S取代，Cl−优先运输。保守区II中的前x残基和保守区III的下第四个残基都可以是E残基。

它们是CLC反转运蛋白的特征，然而，如果在这些位置发现任何其他氨基酸，例如在AtCLCe、AtCLCf和AtCLCg中，这些蛋白质可能会发挥CLC通道活性。

CLC蛋白可能作为Cl−通道或作为Cl−/H-交换剂，克利克+−通道通过耗散预先存在的电化学梯度来介导被动传输，而反转运体通过与能量消耗耦合来介导主动传输。

使基板相对于电化学梯度移动，在高等植物中，CLC蛋白在控制电兴奋性、膨胀维持、气孔运动、离子稳态以及对生物和/或非生物胁迫的响应中起着至关重要的作用。

二、CLC基因参与阴离子运输和对盐胁迫的反应

在拟南芥中，有七个报道的CLC基因：AtCLCa~AtCLCg，它们在不同的细胞器中扮演不同的角色。

Barbierbrygoo等人和Marmagne等人认为AtCLCa~AtCLCd和AtCLCg聚集成一个不同的分支，属于真核CLC，而AtCLCe和AtCLCf与原核CLC通道密切相关。

AtCLCa 代码表示NO3−/H交换剂位于液泡膜中，这与液泡中的硝酸盐积累至关重要。 AtCLCb编码为空泡反转运体，与AtCLCa具有80%的同一性。

在幼根、下胚轴和子叶中高度表达，AtCLCc通过隔离Cl+−在盐胁迫下进入液泡，并在保卫细胞、花粉和根中强烈表达。

AtCLCd和AtCLCf均位于高尔基体膜中，可能在反式高尔基体囊泡网络的酸化中发挥作用，而AtCLCe靶向叶绿体中的类囊体膜。

AtCLCg是与AtCLCc最接近的同系物，在Cl−NaCl应激期间的稳态。在其他植物中，许多CLC基因参与阴离子运输和对盐胁迫的反应。

例如，在NaCl胁迫下，OsCLC-1在水稻中的表达水平上调，PtrCLC基因在盐胁迫下在橙子中被深刻诱导。

已经发现GmCLC1通过减少Cl −枝条积累，和 GsCLC-c2 过表达有助于Cl−和否3−稳态，因此赋予野生大豆耐盐性。

然而，CLC基因的特征尚未在石榴上报道，因此， 本研究对石榴中的CLC基因家族进行了全面的全基因组盘点。

为了揭示Cl的积累模式下，石榴组织中的阴离子及其在PgCLCs吸收和转运中的作用，测定了不同NaCl浓度下石榴组织中PgCLCs的阴离子含量和表达水平。

全面阐明NaCl胁迫下阴离子的积累模式，为进一步研究CLC基因的功能提供参考。

三、石榴中CLC基因家族的系统发育分析

为了阐明陆地植物中CLC基因家族的进化性状，我们研究了15个具有可用参考基因组序列的有趣物种。

我们的结果显示了CLC基因树的两个明显分支，分支I是具有中等支持的主要组和分支II包含两个亚群。PgCLC-E和PgCLC-F属于进化枝II，其他PgCLC属于进化枝I。

进化枝I和II的分化可能发生在陆地植物起源之前，因为每个进化枝都由刺绣植物的分类群组成，系统发育分析表明古代基因多轮扩增。

不同谱系基因拷贝数的多样性，基因树与物种树调和地识别出基因重复，具有强烈支持的拓扑结构 ，这有助于PgCLC-C1和PgCLC-C2之间的重复。

基因复制导致的拓扑结构，被确定为被子植物共享的一个重复，这与PgCLC-C和PgCLC-G之间的重复有关。

我们的系统发育分析还发现种子植物的基因扩增，其基因诞生于古老的基因复制和随后的基因死亡。

CLC-A/B/C/G基因的树拓扑结构在裸子植物中表现出基因丢失事件。CLC-A/B亚科中拟南芥和Eutrema有两个成员，而石榴只有一个成员PgCLC-B。

在这里，我们的系统发育结果表明，1个假定的PgCLC基因起源于陆地植物分化之前，并在经历2次重复后保留下来。

包括 至少一个古代核心真双子叶植物特异性复制和一个被子植物特异性扩增。

四、CLC基因家族的保守基序和残基

为进一步研究陆地植物中所有CLC的结构多样性，分析了其保守的基序和区域。在这里，总共选择了十个基序，称为基序1-10，并显示了每个分类群的五个代表性物种。

在两个分支中清楚地观察到不同的基序图案，对于分支I，大多数CLC具有十个基序。对于进化枝II，大多数CLC-E和CLC-F蛋白具有6个基序：1，8，2和9。

这些基序由进化枝I的所有CLC共享，三个保守区GxGIPE、GKxGPxxH和PxxGxLF分别包含在基序6、基序1和基序2中。

CLC基因家族的三个高度保守区域由进化枝I的成员共享，而它们不由进化枝II的成员共享。此外，为了仔细分析CLC蛋白的保守区域，进行了多序列比对。

CLC-A/B亚家族的成员在保守区GxGIPE中具有P残基，而进化枝I中CLC-C，CLC-G和CLC-D亚家族的其他蛋白质在保守区域I中具有S残基。

和保守区的下一个第四个残基中的质子谷氨酸残基的存在是CLC反转运体的特征。否则，CLC-G亚家族的保守门控谷氨酸和CLC-E和CLC-F亚家族的质子。

谷氨酸残基被其他氨基酸取代，这表明这三个亚科的成员可能是CLC通道。 基于这些结果，我们假设四种PgCLC蛋白是CLC反转运蛋白，而其他三种PgCLC可能是CLC通道。

五、石榴组织中的生长特性和阴离子含量

随着盐度浓度的增加，各处理根和茎干重无显著变化，叶片干重和总干重先增加后降低，在100mM盐度水平达到峰值。

氯含量−石榴根、茎叶随NaCl浓度的增加而显著增加。在300mMNaCl应力下，Cl的水平−根、茎、叶分别比对照增加6.19倍、5.29倍和7.42倍。

氯的含量−在植物组织中被列为叶>茎>根。与对照相比，NO3−根系含量先升高后降低，盐度在100mM时最高。

然而，没有3−茎叶含量无明显变化，除无3−300mM盐度下茎中含量。不3−植物组织中的含量分为根>茎>叶。

相比之下， H2采购订单4−根系含量随盐度的增加而增加，而大多数叶片和茎样品均未观察到显著变化。

我们发现H2采购订单4−主要积聚在茎中，对于SO42−石榴根叶含量和含量呈先增加后减少的趋势，盐度在100mM时达到峰值。

显示4d，SO42−主要积累在根部，SO的含量42−在较高的盐度下，叶片急剧下降。

六、CLC基因家族的系统发育关系

植物中的许多早期全基因组复制事件，包括核心真双子叶植物共享的γ事件，被子植物共享的WGD事件和种子植物WGD事件，都有助于基因复制。

来自不同谱系的基因拷贝数的多样性，可能与与分类单元共享的WGD事件轮次有关。

根据对15种陆地植物CLC基因家族的系统发育分析，将32个PgCLC分为两个分支，其中分支I属于真核分支，分支II属于细菌分支。

进化枝I和进化枝II的分化可能发生在陆地植物起源之前，因为每个进化枝都由刺绣植物的分类群组成，CLC拓扑结构与拟南芥、*草烟**、茶和三叶橙一致。

系统发育分析也表明了多轮古代基因的扩增，例如，PgCLC-C1和PgCLC-C2之间的基因复制，得到了核心真双子叶植物共享的重复突发的支持。

CLC-C和CLC-G亚家族之间的基因重复是由于与被子植物共享的一个重复。 在CLC-A/B亚家族中，石榴中仅鉴定出一个成员PgCLC-B。

虽然有两个成员来自拟南芥和Eutrema，这是由于芸苔科植物共享的特定基因复制，系统发育分析还发现种子植物中的基因扩增，其基因诞生于古老的基因复制和随后的基因死亡。

CLC-A/B/C/G亚科在经历种子植物WGD事件后，裸子植物表现出基因丢失事件，尽管该基因的缺失可能是由于基因组组装和注释的假定不完整造成的。

最近的系统发育研究也发现了陆地植物规模的基因诞生和扩增，例如CYP75基因家族和GH28基因家族。

保守基序和保守区域的分布与系统发育关系一致，CLC基因家族的2个高度保守区域GxGIPE、GKxGPxxH和PxxGxLF由进化枝I的成员共享。

门控谷氨酸残基和质子谷氨酸残基的存在是CLC抗转运蛋白的特征，如果一个或两个Glu残基被保守区域中的任何其他氨基酸取代，CLC蛋白可能表现出CLC通道活性。

七、结论

石榴是一种重要的商业果树，对盐度具有中等耐受性。 氯化物的平衡−石榴组织中的其他阴离子受盐度影响，然而，阴离子的积累模式知之甚少。

氯离子通道基因家族参与传导Cl−不3−，HCO3−和我−但其特性尚未在石榴上报道，在这项研究中，我们鉴定并表征了石榴中的七个CLC基因。

系统发育分析表明，PgCLCs分为两个不同的分支，每个分支成员的保守基序和区域分布相似。

在石榴中，PgCLC基因表现出组织特异性表达模式，盐胁迫下叶片表达量高，根系表达量低。

PgCLCs被认为在Cl的平衡中发挥重要作用−和否3−在盐胁迫下的石榴组织中。我们的研究为PgCLC基因的进一步功能表征提供了基础。