伯小远现在很喜欢看一些学术方面的历史，因为这样可以更深层次地理解“发现问题-提出假设-实验验证-得出结果-分析结果”这个过程，会比大多数时候我们直接知道“结论”更加有意思，特别是其中最关键的一环“发现问题”！大家可以在历史中了解到伟大的发现基本都起始于一个个绝妙的问题的提出，这对于我们目前的科研工作依然无比适用。这种科普会因为很老以至于没有看下去的欲望？那伯小远只能说，你会错失一个精彩的世界！本期的文章伯小远想带大家一起去看看孟德尔七大豌豆性状的分子机制，但是在讲解它们之前，还是先和伯小远一起了解一下孟德尔传奇的一生吧！
孟德尔生平
▲孟德尔画像，图片来源：mendelmuseum.muni.cz。
提起中学课本上“孟德尔（Gregor Johann Mendel，1822-1884）”的名字，你会想到什么？孟德尔定律（遗传学第一大定律和第二大定律）？耗时十年完成系统的豌豆杂交实验？在修道院工作终身未婚？逝去多年才被人理解他超越时代的惊人发现？1843年，21岁的孟德尔因贫寒辍学后，经人介绍进入现今位于捷克的奥古斯丁修道院。当时的修道院是一个地区文化和智慧的中心，闪耀着文明和科学的光芒，孟德尔在此接触到了科学研究，并且还可以使用修道院丰富的图书与实验设施。1851-1853年，修道院院长Cyrill Franz Napp派遣孟德尔去维也纳大学进修自然科学，在那里他学习了物理、化学、数学、动物学和植物学等。1854-1856年，孟德尔测试了34个豌豆品种，从而挑选出适合研究的豌豆品种和相关性状，最终选择了7个易于研究的性状。1856-1863年这八年间，孟德尔在奥古斯丁修道院的小花园里开始了伟大的豌豆杂交实验，基于对大约3万株豌豆的试验，他发现了基因的分离定律和自由组合定律，奠定了遗传学的基石，也因此被称为“遗传学之父”。
▲（左）奥古斯丁修道院的花园，图片左侧的阴影处就是孟德尔当年进行豌豆杂交实验的地方；（右）1920年代同一片区域的照片，为种植豌豆的花园的特写，这个视角正好与左侧的照片相反。图片来源：mendel.imp.ac.at。 1865年，孟德尔在当地的自然科学研究协会举办的会议上两次报告了他的研究结果，1866年又在该会会刊上发表了题为《植物杂交实验》的论文，但遗憾的是，当时的科学家们并未理解和重视这项研究。1868年，孟德尔被选为奥古斯丁修道院的院长，随之而来的行政职责和逐渐衰退的视力使他无法继续进行科学研究工作。1884年，孟德尔去世，去世时他的科研工作仍然鲜为人知。直到1900年，孟德尔的工作被三位植物学家通过各自的工作予以证实，最终孟德尔被公认为科学遗传学的奠基人。
回到过去
孟德尔当时所处的世界是什么样子的？孟德尔做实验的这十年，即1854-1863年，世界上都发生了啥？1851-1864年，太平天国起义。1856-1860年，第二次*片鸦**战争，清朝战败。1859年11月，查尔斯·达尔文发表了《物种起源》，将人类从宗教中解放出来。当时的世界对“遗传”又是怎么理解的呢？19世纪中期，大多数生物学家还秉持着“混合遗传”（blending inheritance）的观点，认为子代性状是亲代性状的平均结果，即父母的黑和白简单融合得到子代的灰，这符合一些人类的遗传特点，但这种观点无法解释更深层次的现象。1868年，达尔文在《动植物在家养条件下的变异》一书里提出了“泛生论”。泛生论是达尔文用来说明性状能遗传的一个理论，他认为生物体各部分的细胞都带有特定的能自身繁殖的粒子，称为“微芽”或“泛子”。这种粒子可由各系统集中于生殖细胞，传递给子代，使它们呈现亲代的特征。大家可以发现，这种理论其实浮于复杂遗传现象的表面，只是简单用结论解释了现象，并没有触及到遗传的本质原因。显然，此时的达尔文未曾注意到孟德尔已于1866年发表的那篇重要论文。我们现在知道，大多数的性状都是由多基因控制的，只有少部分是由单个基因决定的。而多基因的共同作用，使性状出现了复杂的多样性，这种多样性形成了多姿多彩的生命，但也让科学家们对遗传学的研究毫无头绪，就像被困在大海迷雾中的渔夫辨不清出去的方向，而孟德尔的研究成果就像灯塔一般指引着大家走向了科学的研究道路。那么，孟德尔到底发现了什么呢？
孟德尔的豌豆实验
伯小远在第一部分“孟德尔生平”中提到了孟德尔曾发表过一篇题为《植物杂交实验》的论文，强烈推荐大家看下它的英文版本（http://www.mendelweb.org/Mendel.html），两百多年前孟德尔对科学问题的思考以及严谨的实验设计至今仍值得我们学习。这篇论文的主要内容其实我们在高中生物教材上学过，这里帮大家简单复习一下！
图1 孟德尔豌豆实验选取的7大性状，它们分别是种子的形状、子叶的颜色、花的颜色、豆荚的形状、豆荚的颜色、花的位置和植株的高度。图片来源：Wikimedia commons。
单对性状的杂交情况
孟德尔在豌豆杂交实验中研究了7对不同的性状。为了研究某一对性状，他选择两个只在该性状有差异的豌豆植株进行杂交，得到杂交第一代（F1），然后将杂交第一代自交得到杂交第二代（F2），再继续自交得到第三代（F3）等。
图2 孟德尔豌豆实验中对单对性状杂交的结果示意图。以种子的形状为例，圆形种子和皱形种子的杂交第一代全部是圆形种子。将杂交第一代进行自交获得第二代，得到的圆形种子和皱形种子的比例大约是3:1。将杂交第二代进行自交获得第三代，在第二代为圆形的种子所培育出来的第三代子代里，大约三分之一只产生圆形种子，三分之二则产生圆形和皱形的种子；在第二代为皱形的种子所培育出来的第三代子代里，则全部产生的是皱形的种子。
多对性状的杂交情况
图3 孟德尔豌豆实验中对两对性状杂交的结果示意图。以种子的形状和颜色为例，将圆形黄色和皱形绿色种子的两个亲本杂交，所得到的杂交第一代表现出的都是圆形黄色的种子。将杂交第一代进行自交获得第二代，得到的种子有四种表型，分别是圆形黄色、皱形黄色、圆形绿色、皱形绿色，它们之间的比例大致是9:3:3:1。
其他实验
为了确定在豌豆中发现的规律是否也适用于其他植物，孟德尔在菜豆（ Phaseolus vulgaris ）和倭小豆（ Phaseolus nanus ）中也进行了杂交实验，并且得出了与豌豆杂交实验完全一致的结果。
小 结
在整个实验中，孟德尔做了三件超乎寻常的事情：①提出了“显性”和“隐性”的概念，用于区分在F1代中显现的性状和“隐藏”的性状；②使用字母及其大小写来区分性状，而这直接把表型（Phenotype）转变成了一种基因型（Genotype）的表达；③使用统计学来研究整个实验结果，孟德尔对每一次的杂交子代都进行了统计和分析。在研究一对性状的杂交时，得出图2中 F2代3:1的比例，不仅如此，他还把3:1拆解成了1:2:1，即A+2Aa+a。这就是遗传学第一定律：分离定律。在研究两对性状的杂交时，对于图3中 F2代9:3:3:1的比例，他将其拆解成了（4+2+2+1）:（2+1）:（2+1）:1，即（4AaBb+2AaB+2ABb+AB）:（2Aab+Ab）:（2aBb+aB）:ab。而对于三对性状的杂交，研究变得更为复杂，但孟德尔仍然在论文中依据统计的结果给出了对F2代的理解，即ABC+ABc+AbC+Abc+aBC+aBc+abC+abc+2ABCc+2AbCc+2aBCc+2abCc+2ABbC+2ABbc+2aBbC+2aBbc+2AaBC+2AaBc+2AabC+2Aabc+4ABbCc+4aBbCc+4AaBCc+4AabCc+4AaBbC+4AaBbc+8AaBbCc。这就是遗传学第二定律：自由组合定律。
实验植物的选择
孟德尔的豌豆实验非常成功，很多人认为“运气”占了其成功的很大一部分，其中最著名的论调是，他很幸运地选择了豌豆作为实验对象。豌豆在自然状态下，是严格的自花授粉植物，而且是闭花授粉，它的花柱和花药被龙骨瓣紧紧包围，在花未开时就已经完成了授粉，但是它也可以被人工操作进行异花授粉。
图4 豌豆。
图5 豌豆杂交过程。豌豆是自花授粉植物，做杂交时，举个例子，首先将白色花的花药去除，然后使用另一株红色花的花粉给它授粉。
在杂交实验中，豌豆的确是一个很好的研究对象，但是孟德尔选择豌豆真是靠运气吗，让我们来看看他在论文《植物杂交实验》中是如何论述的吧。孟德尔在论文的第二部分中写道： 任何实验的价值和用处取决于所用材料是否符合其目的，所以选什么植物和怎么做实验并非不重要，必须特别小心地选择植物，从一开始就要避免可能获得有疑问的结果。实验植物必须具有以下三种特征：具有稳定的可以区分的分化特征（“分化特征”现在称为“性状”）；杂交种在开花期必须受到保护或易于受到保护，以免受外来花粉的影响；杂交种及其后代的生育力不会发生太大的变化。外来花粉的侵入如果在实验过程中发生且未被察觉，将导致完全错误的结论。在许多杂交种的后代中，生育力的降低甚至不育会使后续实验变得非常困难。为了发现杂交种彼此之间以及与它们祖先之间的关系，有必要对在每一个世代中的所有成员进行观察。在两年的时间中，总共对34种不同的豌豆品种进行了实验。我们可以看出，孟德尔对于实验对象的选择有严格的标准，不然也不会花两年的时间才选出合适的研究材料和性状，因此即便他当时没有选择豌豆做实验，按照他的标准也可以挑选出合适做实验的其他物种，与所谓的“运气”毫不相干呢！
已克隆四个基因
时间来到2010年，此时，孟德尔研究的豌豆7大性状已有4个性状的基因被克隆及研究。不过大家也要知道，由于年限久远，其实较难确定孟德尔当时使用的豌豆品种，而且，从理论上来说，每个基因中有许多可能的突变可以产生相同的表型，所以他当时到底使用的是哪种突变体也较难确认。下面将要介绍的这些被克隆的基因是大家比较公认的结果。
种子形状
Bhattacharyya等发现导致豌豆种子圆形（ R ）、皱形（ r ）不同的原因是皱形种子中淀粉分支酶的一个主要亚型SBE1的功能缺失，其功能缺失的原因是因为在 SBE1 基因中有0.8kb序列的插入，这种插入似乎与来自玉米的Ac/Ds转座子家族非常相似，由此导致种子中淀粉、脂质和蛋白质生物合成的复杂代谢变化，进而影响了种子的外观 (Bhattacharyya et al., 1990)。
茎 长
假设将孟德尔使用的控制茎长的基因命名为 LE （length的缩写），科学家们普遍认为 LE 是通过参与调节赤霉素（GA）的水平来影响茎长的 (Reid and Ross,2011)，发挥主要作用的赤霉素是GA1，其由GA20通过3β-羟基化形成，而LE即为3β-羟化酶。使用拟南芥的 LE 基因对豌豆的cDNA文库进行异源筛选，得到了与探针61%序列相同的克隆，DNA凝胶印迹分析显示在不同豌豆品种间， LE 基因的限制性片段长度多态性与其高/矮差异共分离。将LE野生型和 le-1 突变体（推测为孟德尔使用的矮化突变体）中的 LE 基因在大肠杆菌中表达，前者的LE蛋白可将无活性的GA20转化为有生物活性的GA1，而后者的LE突变蛋白的GA 3β-羟化酶活性则显著降低，究其原因，是 LE 基因序列中的G在突变体中突变为A导致丙氨酸突变成了苏氨酸 (Martin et al., 1997)。
图6 豌豆205＋（LE野生型）和205－（le-1突变体）的表型 (Martin et al., 1997)。
图7 由不同的LE（3β-羟化酶）产生的13C、3H标记的GA20含量 (Martin et al., 1997)。（A）LE cDNA；（B）le cDNA；（C）对照。
子叶颜色
在衰老过程中叶片仍然保持绿色的突变体称为“持绿”（stay green， sgr ）突变体，孟德尔的绿色子叶基因被证明是豌豆的 PsSGR 基因，通过对水稻的 OsSGR 基因的功能分析表明，是一个6bp碱基序列的插入导致了SGR蛋白功能产生缺陷，使 sgr 突变体持绿 (Sato et al., 2007)。
图8 豌豆的 i 突变体始终保持绿色表型 (Sato et al., 2007)。（A）JI4（ II ）和JI2775（ ii ）的种子颜色表型和叶片衰老表型，JI2775（ ii ）突变体即使在衰老的晚期仍保持绿色；（B）暗培养期间豌豆中的叶绿素含量的变化，实线-JI2775（ ii ），虚线-JI4（ II ），实心圆圈-Chl a，空心圆圈-Chl b。由此可见JI2775（ ii ）在暗培养末期仍可保持较高的叶绿素含量。
图9 向 sgr-2 突变体中转入野生型或突变型的 OsSGR 基因的互补试验 (Sato et al., 2007)。（A）向 sgr-2 突变体中转入野生型 OsSGR 基因，得到转基因株系1#、2#、3#，在27℃黑暗中生长6天后摘取叶片，可发现互补的株系叶片变黄，说明转入野生型的 OsSGR 基因表达了正常的SGR蛋白，使持绿的表型消失；（B）向 sgr-2 突变体中转入 OsSGR 突变基因，即在野生型 OsSGR 基因中有一个6bp序列的插入，得到转基因株系1#、2#、3#，在27℃黑暗中生长6天后摘取叶片，可发现互补的株系持绿，由此也可说明正是这6bp序列的插入（其蛋白也对应着两个氨基酸的插入），影响了SGR蛋白的功能，使其发生缺陷而导致持绿表型的出现。
花 色
▲白色和紫色的豌豆花。
通过使用模式豆科植物蒺藜苜蓿的基因组序列以及它们与豌豆基因组的共线性关系鉴定出了豌豆花色基因 A ， A 与花青素色素沉着有关，其编码一个bHLH转录因子。孟德尔使用的白色花突变体是由于剪接供体位点中的碱基G突变为A所导致的，由此最终导致蛋白的提前终止 (Hellens et al., 2010)。
图10 bHLH 基因及其突变基因的结构示意图 (Hellens et al., 2010) 。在白色豌豆花中，在 bHLH 基因第6个内含子的剪接供体位点，碱基G突变为A，破坏了内含子的正常剪接，并导致生成错误的mRNA，即8个核苷酸的插入，这种移码最终使蛋白表达提前停止。
图11 白色豌豆花瓣的粒子轰击互补实验 (Hellens et al., 2010)。使用含豌豆 bHLH 基因的BAC克隆、紫色花PI269818的BAC克隆轰击可以使紫色色素沉着，而对照GFP并不可以。本实验进一步验证了鉴定出的 bHLH 基因确实是豌豆的花色基因A。
小远叨叨
相信大家从上面这些基因的克隆实验可以看出分子生物学实验的进步与发展，现在的研究中可能很少再用探针异源筛选cDNA文库来克隆某个物种基因的实验了，与此同时，可以比较方便的通过基因编辑技术来敲除基因功能而不是只能转化大肠杆菌来验证推论了。伯小远在参加去年第二十三届全国生物固氮学术研讨会时，某课题组报告已用GWAS技术解析了孟德尔7大性状基因中未被克隆的三个基因，但是伯小远找了半天的资料也未查到，不知道是不是还未发表呢，大家如果看到相关文献还麻烦告知一下伯小远哈！读史可以明智，知古方能鉴今！读生物学的历史亦是如此！借用牛顿的一句话：我们之所以看的远，那是因为我们站在巨人的肩膀上！作为后人，我们不仅要缅怀先辈，还要学习他们的精神，知识可能会变得陈旧，但精神永不过时！最后小远想问问大家，人类生物学智慧的巅峰之一——孟德尔的豌豆实验——其魅力你get到了吗？伯小远 References：Bhattacharyya MK, Smith AM, Ellis TH, Hedley C, Martin C (1990) The wrinkled-seed character of pea described by Mendel is caused by a transposon-like insertion in a gene encoding starch-branching enzyme. Cell 60 (1):115-122.Hellens RP, Moreau C, Lin-Wang K, Schwinn KE, Thomson SJ, Fiers MW, Frew TJ, Murray SR, Hofer JM, Jacobs JM, Davies KM, Allan AC, Bendahmane A, Coyne CJ, Timmerman-Vaughan GM, Ellis TH (2010) Identification of Mendel's white flower character. PLoS One 5 (10):e13230.Martin DN, Proebsting WM, Hedden P (1997) Mendel's dwarfing gene: cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 94 (16):8907-8911.Reid JB, Ross JJ (2011) Mendel's genes: toward a full molecular characterization. Genetics 189 (1):3-10.Sato Y, Morita R, Nishimura M, Yamaguchi H, Kusaba M (2007) Mendel's green cotyledon gene encodes a positive regulator of the chlorophyll-degrading pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (35):14169-14174. NO.1好文推荐 载体构建的"利器"--Golden Gate “追光”植物背后的故事（一） 未来已来，开启“造物”时代！ 谈谈CRISPR/dCas9系统的“百变”应用（二） 你还在小瞧质谱吗？ 袁隆平爷爷心系的“一系法”，能否实现？ NO.2伯远生物可以提供以下技术服务 十六大植物遗传转化 各物种基因编辑全套服务 各种分子检测业务 蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用筛选及验证