阅读此文前，麻烦您点击一下“关注”，方便您进行讨论和分享，给您带来不一样的参与感，感谢您的支持。
文 | 枫月书生A
编辑 | 枫月书生A
前言
通过使用 ACE2功能化 的 微锥形无芯光纤 (ST-NCF)演示了SARS-CoV-2刺突蛋白的无标记检测。
在制造的传感器头中，单模光纤和无芯光纤之间接口处模场直径的突变会激发多导模并促进 多模干涉（MMI） 。
其略微锥形的区域使MMI对周围介质的折射率(RI)调制更加敏感。
选择MMI光谱的 透射率最小值 作为传感器指标，通过预处理过程，传感器表面使用ACE2生物受体进行功能化。
功能化
2020年1月，严重 急性呼吸综合征（SARS） 新型冠状病毒的基因信息向全球发布。世界卫生组织将发现的新型病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。
由于SARS-CoV-2的受体结合基因结构与 SARS-CoV 非常相似，因此推测SARS-CoV-2在浸润细胞时会使用与SARS-CoV相同的受体，并且在后来的研究中证明SARS-CoV-2也使用血管紧张素转换酶2（ACE2）作为 受体 。
首先，将固定 ACE2的ST-NCF传感器头 暴露于浓度范围为1至104的SARS-CoV-2刺突蛋白样品中 纳克/毫升。
随着样品浓度的增加，观察到指示剂倾角向更长的 波长区域 移动。
观察到的光谱变化归因于传感器表面的局部RI调制，这是由ACE2和SARS-CoV-2刺突蛋白之间的 选择性生物亲和力 结合引起的。
此外，还确认了传感器头作为一种有效且简单的 光学探针 的能力，通过应用唾液溶液作为测量缓冲液来检测抗原蛋白样品。
此外，还比较了其对SARS-CoV-2和MERS-CoV 刺突蛋白的检测敏感性 ，以检查其交叉反应性。
特别是，通过使用用ACE2重建的ST-NCF传感器头证明了此处采用的生物测定协议的重要性。
就其他病毒而言，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和甲型冠状病毒（Alpha-CoV）分别使用二肽基肽酶4（DPP4）和氨肽酶N（APN）作为受体。
人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63)也可以利用ACE2，但与SARS-CoV相比，其结合亲和力较低。
冠状病毒是直径为80至125nm的球形结构，具有源自宿主细胞质膜的病毒包膜。
病毒包膜由刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）和包膜蛋白（E）三种病毒结构蛋白组成，膜内含有核衣壳蛋白。
特别是，已知冠状病毒的刺突蛋白对于病毒通过与宿主细胞的受体相互作用而穿透细胞至关重要。
令人惊讶的是，一些研究报道SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2的结合亲和力比SARS-CoV刺突蛋白更大。
SARS-CoV-2突变体可能会增强SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2之间的相互作用。
实时聚合酶链式反应（RT-PCR）因其对检测COVID-19感染的高选择性和灵敏度而成为金标准方法。
由于RT-PCR的假阴性结果，人们对生物传感器作为替代和首次测试越来越感兴趣。
最近，在功能性ELISA测定中发现SARS-CoV-2刺突蛋白可以与人类ACE2蛋白结合。
一种与等离子体光热(PPT)效应相结合的双功能局域表面等离子体共振(LSPR)生物传感器，显示出对SARS-CoV-2病毒核酸的敏感性，检测限(LOD)为0.22pM。
为了快速诊断SARS-CoV-2刺突蛋白，基于石墨烯的场效应晶体管生物传感器与SARS-CoV-2刺突抗体功能化，并在培养基中实现了1.6×101pfu/mL的LOD，在临床样品中实现了2.42×102拷贝/mL的LOD。
提出了一种与分子印迹聚合物集成的电化学生物传感器，能够检测SARS-CoV-2核蛋白，其在检测SARS-CoV-2蛋白时表现出线性响应，LOD为15fM。
具体来说，在处理包括病毒在内的各类生物材料的无标记生物传感领域，光纤传感器由于其抗电磁干扰、电钝性、化学惰性、多路复用能力和快速响应等特点，作为检测生物元素的重要平台而得到了稳步研究并引起了广泛关注。
光学生物传感平台依赖于测量由于生物识别元件和生物分析物之间的结合而导致的表面局部折射率（RI）的变化。
表面局部折射率
基于此原理的光学传感器包括长周期光纤光栅（LPFG）、光纤布拉格光栅（FBG）、基于表面等离子共振（SPR）的光纤探针、U型弯曲光纤、基于荧光的光纤探针和锥形光纤（TOF），其目的是提高生物反应的灵敏度。
例如，一种基于氧化石墨烯/银包覆聚合物包层二氧化硅纤维的SPR生物传感器，其表面固定有抗人免疫球蛋白G(IgG)，用于检测人IgG。
像是一种涂有miRNA-133a的U形光纤生物传感器，用于检测microRNA。
固定有登革热病毒E蛋白抗体的锥形单模光纤(SMF)传感器，用于检测登革热病毒。
开发了一种带有猪IgG抗体功能的锥形无芯光纤(NCF)耦合器传感器，用于检测金黄色葡萄球菌。这种TOF传感器头的锥形直径为10.4μm，对周围介质RI高度敏感。
与此同时，人们认为传感器头非常难以处理，因为它很容易受到轻微弯曲或扭曲以及弱拉伸应变所施加的横向应力的影响。
因此，尽管由于TOF传感器在测量化学或机械量（包括生物传感领域）的不同领域中具有高灵敏度的优势，与TOF传感器相关的一些研究已经稳步进行，但仍然存在锥形部分的脆弱性的关键问题，这降低了所制造的传感器的可持续性和稳定性。
在这里，我们提出了一种稍微锥形的NCF(ST-NCF)，其两端与SMF连接作为光纤传感器，用于SARS-CoV-2刺突蛋白的无标记检测。
为了获得比其他TOF传感器更坚固的光纤传感器头，使用商业标准光纤熔接机以简单且可重复的方式将制造的传感器中的NCF段逐渐变细，包层直径约为100μm。SMF和NCF之间接口处模场直径的突然变化会激发多种传播模式，而多导模在引出SMF处相遇时会产生多模干扰(MMI)。
传感器头的表面采用人类ACE2生物受体进行功能化，可以特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白。
这是第一项利用与人ACE2蛋白缀合的ST-NCF诊断SARS-CoV-2刺突蛋白的研究。
这项研究的意义在于，所制造的ST-NCF不仅对横向应力相对稳健，而且在适当的生物功能化后对靶向病毒包膜蛋白也足够敏感。
在功能化传感器头的MMI光谱中，选择透射率最小值作为传感器指示剂倾角，反映生物受体和目标分析物之间的生物亲和力相互作用。
为了研究SARS-CoV-2刺突蛋白的检测能力，对PBS和唾液缓冲液中不同浓度的刺突蛋白样品溶液监测传感器指示剂的波长变化。
尤其，为了确定通过检测SARS-CoV-2刺突蛋白获得的传感器响应是否归因于其与ACE2生物受体的特异性相互作用，通过测量其对MERS-CoV刺突蛋白以及SARS-CoV-2刺突蛋白的响应来检查传感器头的交叉反应性。
ST-NCF传感器头
作为制造ST-NCF传感器头的第一步，NCF（FG125LA，Thorlabs）段的任一端均与SMF熔接。
NCF的包层直径为125μm，NCF的最佳长度被定制为28mm，以获得MMI光谱凹陷，其波长落在此处用于生物传感的宽带光源的输出波长范围内。
当在输入SMF中传播的光进入NCF时，由于模场不匹配，在NCF区域内会激发一系列高阶模，随后当光传播到输出SMF时会发生基模和高阶模之间的干扰。
两端与SMF相连的NCF可以看作是一个MMI设备，由于该MMI设备的周围介质可以充当NCF的包层，因此NCF内的导模很容易受到周围介质RI变化的影响。
因此可以根据周围介质RI的外部扰动引起这里产生的MMI波长的显着偏移。
在基于NCF远截止近似的波导模型中，该模型是从用于多模光纤模态分析的弱引导近似修改而来的，归一化光频率由下式给出：
（1）
其中α、λ、nncf和nmedia分别是NCF的半径、自由空间波长、NCFRI和周围介质RI。
因此，MMI装置NCF区域机械变形或表面RI波动的存在可能引起V的变化，现在与由于多个高阶模式的耦合而导致的传播模式的倏逝波部分增加相关，这导致灵敏度增强。
假设SMF和NCF理想对齐，使得输入场变为圆对称，则仅LP0m模式（即NCF的高阶模式）可以被激发。
MMI装置(即SMF-NCF-SMF结构)的输出透过率(T)可以确定为：
（2）
其中M是NCF段的模式总数，L是NCF段的长度，c0m是LP0m模式的激励系数，β0m是LP0m模式的传播常数。
此外，将锥度纳入基于NCF的传感器中增加了倏逝场的大小，从而增加了其穿透深度，从而可以更灵敏、更准确地测量应用于传感器表面的物理或化学参数。
利用TOF的光纤传感器基于倏逝波传感，这是检测生物分子的转换机制之一。
由于逐渐变细的过程增加了倏逝场并将其暴露于周围介质，因此可以提高TOF传感器的灵敏度.
因此可以观察到输出信号中相对于周围介质的RI变化的调制深度增加。
在由ST-NCF和SMF（与ST-NCF的任一端连接）组成的传感器头中，ST-NCF段是通过使用光纤熔接机使NCF变细来制造的。
与火焰加热、化学蚀刻和CO2激光照射等其他方法相比，基于熔接机的锥度方法具有控制方便、重复性好的优点。
补充信息的“无芯光纤的拉锥条件”中详细描述了优化的拉锥条件。
所制造的ST-NCF传感器头的几何结构示意图，ST-NCF段的锥形腰部直径和锥形长度分别约为103和340μm。
图1a和b分别显示了所制造的ST-NCF传感器头的低真空扫描电子显微镜图像和光学显微镜图像。
图1
制备好的ST-NCF传感器头将通过后续的表面处理过程，对SARS-CoV-2刺突蛋白检测受体进行生物功能化。
在对ST-NCF传感器头进行表面改性之前，在室温下在1.333至1.420的RI范围内仔细检查传感器指示器的RI响应，即在ST-NCF传感器头的MMI光谱中选择的空气中接近1516nm的透射最小值。
图1a所制造的ST-NCF传感器头的光纤结构示意图
当水溶液中蔗糖的浓度从0增加到50%时，即当ST-NCF传感器头的周围介质RI增加时，指示剂倾角向更长的波长区域移动，显示总波长偏移约10.84nm。。
1b是在1510至1550nm波长范围内绘制的放大版本。
图1b制造的（裸）ST-NCF传感器头指示剂倾角的光谱变化，在室温下测量外部RI变化1.333至1.420
ST-NCF传感器头的RI灵敏度测量为126nm/RIU，调整后的R2值为0.9923。
ST-NCF传感器头的表面功能化
为了将生物敏感性引入到制造的ST-NCF传感器头上，需要一个预处理过程，用生物受体对传感器头表面进行功能化，该生物受体可以特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白。
图2a显示了ST-NCF传感器头的表面功能化过程的示意图。
图2a用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白的制造ST-NCF传感器头的表面功能化过程示意图
功能化过程由以下步骤组成：Piranha清洁和洗涤，APTES硅烷化，GA处理，EDC/Sulfo-NHS活化，ACE2固定，去除未结合的ACE2，BSA封闭非特异性结合位点。
通过上述顺序功能化程序，制备了用ACE2功能化的ST-NCF传感器头作为用于检测目标分析物的生物传感免疫传感器。
图2b表示ST-NCF传感器头的透射光谱，在将ACE2生物受体固定在其表面之前和之后在空气中测量，分别用黑色和绿色实线显示。
图2b将ACE2生物受体固定在其表面之前和之后在空气中测量的ST-NCF传感器头的透射光谱
显示了1460至1480nm波长范围内透射最小值附近的放大透射光谱。
据观察，由于表面处理的影响，在功能化过程完成后，裸ST-NCF传感器头在1468nm附近的透射最小值向较长波长区域移动了约1.38nm。
尽管波长偏移的程度不同，但在各个功能化过程（包括APTES硅烷化、GA处理、EDC/Sulfo-NHS活化和ACE2固定化过程）之后也观察到了传输下降的波长偏移。
使用ACE2固定的ST-NCF传感器头检测SARS-CoV-2刺突蛋白的实验装置。
使用宽带光源（FiberlabsFL7701）和光谱分析仪（YokogawaAQ6370C）来测量生物功能化传感器头的透射光谱中扰动引起的变化。
由于光源的宽带输出通过传感器头的光纤波导传送到光谱分析仪，因此可以监测由传感器头表面发生的生物反应，引起的透射光谱中指示剂倾角的光谱变化，尤其是波长偏移。
频谱分析仪是远程控制的，其频谱数据由笔记本电脑使用LabVIEW实时采集。
作为定量评估生物受体和分析物之间结合反应的最后一步，将ACE2共轭ST-NCF传感器头放置在玻璃容器中，并将其两端连接到固定台上，以便在光谱测量过程中保持笔直。
因此，制备了不同浓度的SARS-CoV-2刺突蛋白溶液样品，通过使用PBS依次稀释储备溶液，依次形成1、102、103和104ng/mL。
然后，将溶液样品施加到固定有浓度为250μg/mL的ACE2的ST-NCF传感器头上。
由于完全覆盖传感器头表面的最小体积为100μL，因此每个样品浓度使用100μL的SARS-CoV-2刺突蛋白溶液。
在检测人类唾液中的SARS-CoV-2刺突蛋白时，将用作测量缓冲液的唾液稀释1/103与PBS。
两个ST-NCF传感器头在相同条件下制造，包括锥度条件（具体为熔接机条件）和表面功能化条件，分别用于PBS和唾液实验。
所有溶液样品的施加仅通过移液进行，而不移动ST-NCF传感器头，直到传感器头的整个表面被溶液样品覆盖。
结语
首次采用ACE2功能化的ST-NCF传感器头对SARS-CoV-2刺突蛋白进行无标记检测。
为增强灵敏度而应用于NCF的轻微锥度可提供对横向应力的相对鲁棒性，并且使用用于NCF锥度的标准光纤熔接机提供了一种简单且可重复的方法来制造用作裸光纤传感器头的ST-NCF段。
通过硅烷化和交联过程，使裸露的传感器头与人类ACE2生物受体功能化。
利用结合ACE2的ST-NCF传感器头，我们通过观察指示剂浸角中扰动引起的波长变化，研究了其检测PBS和唾液溶液测量缓冲液中SARS-CoV-2刺突蛋白样品的能力。
通过对指标跌幅的实时瞬态监测，可以检查ACE2和SARS-CoV-2刺突蛋白之间持续结合反应的趋势，并证实在30至60秒内快速检测所有样品浓度。
特别是，使用MERS-CoV刺突蛋白的交叉反应测量结果证实了传感器头对SARS-CoV-2刺突蛋白的选择性。
最后，通过使用重建的ST-NCF传感器头迭代之前用唾液溶液完成的测量过程，验证了此处采用的生物测定协议的再现性。
此外，考虑到其制造所用的所有材料的成本，一个传感器头单元的成本估计低于20.9美元。
快速检测能力、目标特异性、可重复使用性,ST-NCF传感器头的出色性能和可重复性为低成本便携式光纤生物传感器提供了足够的潜力，可用于早期检测SARS-CoV-2刺突蛋白。
此外，基于生物识别元件的光纤诊断平台（即ST-NCF传感器）可以通过采用具有目标特异性的适当受体来扩大其目标分析物的范围。