实验动物
选用健康6月龄清洁级雄性新西兰大白兔16只，由*疆新**医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2018-0003，体质量2.0-2.5 kg[5]。实验动物单笼喂养，饲养房温度20-25 ℃，湿度 30%-60%，日夜周期各12 h，自由饮食，使用滚珠饮水器饮水[6]。利用SAS9.4根据样本量产生1∶1随机数字表将新西兰大白兔均分为模型组和对照组。
仪器
恒温箱(DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司)；恒温鼓风干燥箱(DHG 型，上海精宏实验设备有限公司)；Nikon生物显微镜(E200)；盖玻片(江苏世泰试验器材有限公司)；染色缸：内径为15 cm的带盖玻璃缸；高分子绷带(广东省揭西县泰洲医疗科技有限公司，批号201600163)。
实验试剂
体积分数4%中性甲醛固定液，脱钙液(20181216，北京索莱宝生物科技有限公司)；二甲苯(天津市富宇精细化工有限公司)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；苏木精染液(CTS-1097，福州迈新生物技术开发有限公司)；伊红染液(ZLI-9613，北京中杉金桥生物技术有限公司)；中性树胶(ZLI-9555，北京中杉金桥生物技术有限公司)。
实验方法
1 动物模型的制备
模型组采用屈曲位高分子绷带结合塑料杆固定左侧膝关节，建立兔膝骨性关节炎模型[4]，8周后去除高分子绷带[7]。具体步骤如下：①剪取长约6 cm (保证足够包绕兔胫骨一圈)、宽约兔踝关节至膝关节长度一半的树脂高分子绷带2块，再剪取12 cm(足够包饶兔股骨一圈)，宽约兔膝关节至腹股沟长度一半的树脂高分子绷带2块；②将所得4块树脂高分子绷带水浴加热至80 ℃，待其变软后，用镊子夹出第1块较大的树脂高分子绷带，用纱布吸去其表面水分后，垂直于长轴方向包绕兔左下肢膝关节，把握松紧适度，范围从膝关节上1 cm至腹股沟处，较短一条高分子绷带垂直于胫骨方向在膝关节下1 cm处包饶胫骨一圈；③待树脂高分子绷带两个侧边粘连牢固后(约15 s即可)，观察30 min内兔左侧下肢足掌有无充血、紫绀及水肿等症状，若有不良情况发生立即解除制动装置消肿后重新固定；④再采用剩余较长一条高分子绷带将塑料杆的一头固定于股骨端高分子绷带的表面，待高分子绷带变硬前将塑料杆与股骨形成的夹角调整至60°左右，此端固定后将兔膝关节弯曲至75°左右，将塑料杆的另一端采用较短的一条固定于胫骨端高分子绷带的表面；⑤与单纯石膏固定法相比较，此次实验改良之处是在高分子绷带干燥变硬，弯曲兔膝关节75°左右在胫骨与股骨之间用塑料杆架构出三角形，并且使用高分子材料在两端固定，见 图1A 。塑料杆两端的纹路与高分子材料结合，当高分子材料冷却变硬后可以与塑料杆固定，加强了三角形的稳定性，膝关节弯曲角度可控，见 图1B 。每日检查高分子绷带固定情况，若有塑料杆脱落只需重新固定表面塑料杆即可。造模过程示意图见 图2 。对照组动物给予常规喂养，不进行任何干预。
注意事项： 实验采用的塑料杆均来自一次性1 mL注射器中的推杆，推杆两头均有可以被高分子绷带包饶的平头，可以在塑形后卡在高分子绷带中，起到限制兔膝关节活动的作用，在高分子绷带冷却塑形前将包饶塑料杆两端的地方反复按压，可以加强其包饶固定作用；塑料杆其强度适中较耐啃食，质量轻不易造成兔行动负担。
2 质量控制
①所有实验动物膝关节固定装置均由同一名试验人员完成，所有膝关节固定前均使用量角器将角度控制在(75±3)°；
②造模期间每天3次(9：00；14：00；18：00)观察试验动物固定装置局部有无啃食或者局部组织缺血坏死，及时修复固定装置及防止意外情况发生。
3 标本取材及处理
模型组固定8周后，将实验动物的高分子绷带拆除，麻醉后处死所有动物。剔除兔膝关节处毛发并清理周围肌肉和结缔组织，然后用咬骨钳取下膝关节，修剪组织，只保留左膝股骨髁局部，并且将组织放置于预先配置的固定液中，对照组用同样的方法取下左膝股骨髁浸入固定液中24 h，之后置入脱钙液中36-48 h，并在24 h后每隔5 h观察关节软骨的软硬程度，防止过度脱钙。常规石蜡包埋后纵行切片，切片厚度5 μm，将组织切片置于65 ℃恒温箱中烘烤1.5-2 h。
4 苏木精-伊红染色组织病理学观察
将组织切片置入二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min脱蜡。无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，体积分数95%、90%、80%、70%乙醇、蒸馏水各5 min水化，苏木精复染3 min，盐酸乙醇分化数秒(一两秒)，自来水中终止分化5 min。置蒸馏水、体积分数70%，80%，90%，95%乙醇中各3 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min脱水。用0.5%伊红乙醇液对比染色1 min，将切片放入95%乙醇中洗去过量的红色，然后放入无水乙醇中5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，最后用中性树胶封固。
主要观察指标
①光学显微镜下观察样本的滑膜、软骨及半月板的形态、数目、排列等情况；
②参照Mankin评分对关节软骨进行评分，Mankin满分14分[10]，评分越高说明软骨退变越严重。
信息来源：中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (23): 3690-3695.