《霸王别姬》本是楚霸王和虞姬的故事，电影讲得却是段小楼和程蝶衣戏里戏外，如戏一样精彩的别样人生。
影片一开场，段小楼和程蝶衣两人来到戏台上，想起多少年没在一起唱戏了，全场灯光暗下来，一束追光打下来，两个人被照在灯光下，响亮的京剧伴奏响起，故事就这么开始了，真的是人生如戏。
艳红带着小豆子来投奔戏班，可是师父看了小豆子的六指不同意。艳红一怒之下，拉着小豆子走到街边，拿起磨剪子的菜刀，手起刀落，一下就砍了小豆子的六指。这一刀，仿佛把小豆子阉割了一样，这一刀就让小豆子开始了他的戏曲人生，这一刀，不得不让小豆子重新认识自己的性别，这一刀，彻底改变了他的人生。
孩子们嘲笑小豆子是窑子里来的，大师兄照顾小豆子，小豆子还不领情。等到大师兄踢开小豆子练腿的石头，被师父责罚，冻得不行的时候，小豆子才拿被子裹住大师兄。小豆子抱着大师兄的后背，两个孩子的心走在了一起。
小豆子唱思凡，一直在出错，一直在坚持自己的性别，不能入戏。师父怎么责罚也没有成效。面对戏班经理，小豆子再次出错。为了挽救局面，大师兄气得拿起烟袋就往小豆子嘴里塞。小豆子再次被阉割，让他彻底入了戏，忘记了自己本身的性别角色。小豆子在戏班经理面前，总算唱对了台词。
小豆子和大师兄登台表演霸王别姬，获得好评无数。张公公还特别让小豆子去谢赏。没想到张公公根本不是喜欢小豆子的表演，只是为了满足自己变态的恋童癖。戏曲艺术，被张公公玷污了。
两人终于成了角儿，也用上了段小楼和程蝶衣的艺名。蝶衣为小楼勾脸，可谓是一起梳妆，一起登台，一起宽衣，两人过得倒也逍遥快活。袁四爷想请两位吃酒，都没有人捧场。
可是菊仙的出现，让程蝶衣很不安。程蝶衣并不在乎菊仙的身份，毕竟他的母亲也是同样身份。他在意的是，菊仙抢走了段小楼。程蝶衣一再阻止段小楼跟菊仙来往，可是段小楼根本不听。
蝶衣无奈跑去跟袁四爷喝酒。袁四爷懂戏，甚至连楚霸王走几步都门清。袁四爷要跟蝶衣坐红颜知己。蝶衣不能跟段小楼唱戏，那么袁四爷成了一个很好的替代品，说白了就是备胎。只有袁四爷还能让他活在戏里。
段小楼打了日伪军，被抓走。程蝶衣本来要去救小楼，可是菊仙来求他快去，蝶衣却不愿意去了。菊仙无奈答应他，只要他救出小楼，自己从哪来回哪去，再不干涉他们唱戏。蝶衣很高兴，兴致勃勃去救小楼。
段小楼出来，并没有感激蝶衣，认为他给日本人唱戏，非常瞧不起他，还吐了吐沫在蝶衣脸上。段小楼忙着去跟菊仙成亲。菊仙不想让段小楼继续唱戏了，只想生娃过安稳日子。程蝶衣跟袁四爷吃饭喝酒，可是仍然找不回戏里那种感觉，无奈的他抽起来大烟打发时光。
程蝶衣被人以汉奸罪抓了起来。段小楼和菊仙找袁四爷帮忙希望能救他出来。庭审上，蝶衣不愿意回到现实中，不能唱戏他倒情愿去死。可偏偏事与愿违，当局还是保住了蝶衣，让他继续为权贵们唱戏。
解放了，袁四爷却被公开批斗，还被处死了，这让段小楼非常震惊。
段小楼和菊仙费劲九牛二虎之力帮程蝶衣戒了烟瘾。
小四等人找段小楼和程蝶衣来评价现代戏。程蝶衣实话实说，看不上现代戏，激怒了小四等人。段小楼无奈承认现代戏也是戏。现实面前，两人再次分道扬镳。
小四原本是程蝶衣捡来的孩子，师父去世后，还亲自教他唱戏。没成想，小四却忘恩负义。
程蝶衣一心想着登台，跟段小楼一起唱戏。小四却搅局，扮演上了虞姬，夺了蝶衣的戏份。段小楼想罢演，蝶衣却让他上场。看着众人纷纷上场，蝶衣默默离去，登台演出成了奢求的梦想。
演出完，段小楼还给程蝶衣解释，希望他认清时代。蝶衣却出来，一把火烧了虞姬的戏服，彻底断了演戏的念想。
*革文**期间，段小楼面对小将们的逼迫，无奈揭发程蝶衣的过往，一一栽赃。程蝶衣气愤不过，开始揭发菊仙，他一直认为是菊仙害得他们哥两个不能一起唱戏。段小楼当众宣布跟菊仙划清界限。菊仙无望自杀。可是，物是人非，两个人终究没能一起唱戏。
回到开场的戏台，段小楼一句思凡的唱词，让程蝶衣恢复了男儿身份。程蝶衣竟然又唱成了“我本是男儿郎，又不是女娇娥”。多年不唱戏，他已经从戏里出来了，这无疑宣布了他的艺术生命的终结。一个人戏不分的人，却突然看清了自己本来的面目，这还怎么唱下去？
最后，程蝶衣拔剑真的自刎了，用自己的死来成全了自己的艺术生命。
霸王别姬，真的是一场如梦如幻的艺术交响。人生如戏，粉墨登场，就要扮演好自己的角色。曲终人散，人走茶凉。戏里戏外，真的能人戏不分吗？