文 | 农牧简说
编辑 | 农牧简说
介绍
低钙饲粮提高了蛋鸡的钙保留率，降低了绝对保留率。同样，限制钙可以保持骨骼健康，而终生高钙摄入会增加老年人骨质疏松性骨折的风险。
根据成骨细胞老化理论(即与年龄相关的成骨细胞复制能力)，较高的骨钙摄入量与成骨细胞活性升高相关，从而导致更大的成骨细胞凋亡，导致不可修复的微骨折和骨质疏松性骨损伤。
此外，作为满足重要器官钙离子需求的一种补偿机制，低钙摄入(膳食钙缺乏)会引起肠道钙吸收和肾脏钙重吸收。
肠道微环境、基因表达和肠道菌群组成的变化有助于增加肠道钙的保留和吸收，从而通过肠道微生物-骨轴促进骨骼健康。
本试验旨在通过测定蛋鸡蛋和骨参数、钙吸收、肠道组织形态学、肠道微生物群组成和肠道转录组的变化，探讨低钙饲粮对蛋鸡肠道微生物群与骨通讯的影响。该结果将为预防蛋鸡骨质疏松提供参考。
材料与方法
2.1动物伦理声明
本研究的所有程序均经西南大学动物保护与使用委员会批号:IACUC2019022519)。
2.2实验设计与动物
选取24只48周龄罗曼粉壳蛋鸡，随机饲养在传统单鸟笼中(n=12个/处理，每个40 cm ~ 35 cm ~ 35 cm)，饲喂低钙饲粮(Ca: 2.04%， LC) (Jiang et, 2019;Yu等，2021)或普通钙饲粮(钙含量:3.72%，对照组)60 d(表1)。
饲粮购自一家饲料公司(中国重庆北碚)。试验期间，每天光照16 h，光照时间为30 lx，饲料和水自由供应。
2.3样品收集
在第29 ~ 30天和第59 ~ 60天，每天09:00 ~ 9:15采集鸡蛋，分析蛋壳质量。记录每日产蛋量、破蛋数和软壳蛋数，并按以下公式计算可售蛋比:可售蛋比1 / 4(总蛋数-破蛋数-软壳蛋数)-总蛋数100%。
按照先前公布的程序(n =12/处理)，在第59天和第60天记录和计算采食量(Jiang等，2013年a)。在第60天(n=12/处理)，在每个鸟笼底部铺上塑料布，收集每只鸟的粪便样本。
在61 d时，为避免饲养和蛋壳形成阶段对生物学参数的影响，母鸡禁食12小时，并在采血前立即触诊每只母鸡的子宫，以确认子宫内缺蛋。
采用戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)麻醉。然后将每只母鸡(n=12)的血液分别经心脏穿刺送入血清管和血浆分离器EDTA管。收集血清或血浆时，在4℃下，2000 g离心15分钟。血清和血浆样品均保存在-80℃保存至分析。
采集血液样本后，以颈椎脱臼对鸟类实施安乐死。取每只左股骨中点周围3 cm骨标本，分析Ca、P、Mg含量，取整只右股骨和胫骨测定骨参数。
骨样本保存在-20C。分别收集十二指肠、空肠、回肠和盲肠的内容物，于-80℃冷冻至测定。
收集十二指肠、空肠和回肠中点(5.0 cm/份)的肠道标本，用0.9%生理盐水轻轻冲洗以清除肠道内容物，然后用10%福尔马林固定直至分析。
2.4鸡蛋和骨头参数分析
使用鸡蛋分析仪测量蛋重。蛋壳强度采用鸡蛋力仪测量。蛋壳厚度测试采用蛋壳厚度计。鸡蛋形状指数是用游标卡尺计算鸡蛋的垂直长度与横向长度之比。
使用分析天平(HZK-FA，豪智电子科技有限公司，福建，中国)对不含软组织的右侧股骨和胫骨进行称重。
采用游标卡尺测量胫骨和股骨中点处的宽度，采用引流法测量骨体积，即将骨浸入0.9%的生理盐水容器中获得的流体值的差异。
骨密度通过InAlyzer 进行扫描，断裂强度根据我们之前发表的方案，使用材料试验机进行三点弯曲测试。
2.5蛋壳、骨骼、粪便中钙、磷、镁含量及肠道钙吸收分析
每个左大腿骨、蛋壳和新鲜粪便(n=12/处理)在105℃的空气烘箱中干燥，直到达到恒定重量。
然后，每种干燥样品的0.1 g在200℃的电加热板上碳化，然后在550℃的马弗炉中灰化3小时，以获得样品的无机质量。
所有灰化样品溶解在65%保证试剂硝酸中，然后用超纯水稀释至50 mL。Ca、P和Mg含量分析采用电感耦合等离子发射光谱仪。
钙潴留量按以下公式计算:钙潴留比=(钙摄入量e粪便中钙含量)/钙摄入量100%。
2.6血液参数分析
采用全自动生化分析仪分析血清碱性磷酸酶、钙和磷，采用TRACP检测试剂盒分析抗酒石酸酸性磷酸酶。
血浆IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子- α 、1,25-二羟基维生素D 、甲状旁腺激素、降钙素、脂多糖、D-乳酸和雌二醇水平按照公司(厦门汇佳生物技术有限公司，福建，中国)提供的说明使用ELISA试剂盒进行检测。
2.7肠道组织形态学及肠道内容物pH值测定
肠道样品用梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(每片3mm厚度)使用滑动切片机，然后用苏木精和伊红溶液染色。
采用ImagePro Plus 6.0软件对小肠各节段绒毛长度和隐窝深度进行分析。用超纯水稀释十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物(1:50)。
使用涡旋混合器(XH-C，迈兴康有限公司，中国台州)将混合物均匀混合，然后使用pH计测量pH值。
2.8微生物多样性分析
使用e.zn.a.土壤DNA试剂盒，按照制造商的方案，从每组盲肠内容物样本中随机提取微生物DNA。
Illumina MiSeq测序和一般数据分析由一家商业公司进行。使用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定每个样品的最终DNA浓度和纯化。
我们之前发表的文章提供了获取原始数据的详细过程。原始读取已存入NCBI序列读取档案(SRA)数据库。
2.9转录组测序
采用TRIzol 从12个回肠样本中随机抽取3个样本，提取总RNA，采用DNase I 提取基因组DNA。
使用2100生物分析仪(测定RNA的质量和数量。获取原始数据和分析的详细过程已在之前发表。原始读取已存入NCBI序列读取档案(SRA)数据库。
结果
3.1蛋壳和骨骼质量
各处理对体重无显著影响(P > 0.05，表3)。与对照饲粮相比，低钙饲粮降低了蛋壳厚度(P=0.006)和蛋壳强度(P=0.02)，提高了蛋形指数(P=0.04)。
低钙日粮对蛋鸡产蛋量(P < 0.41)和可销蛋量(P < 0.25)无显著影响。此外，低钙饲粮降低了股骨长度(P=0.04)、最大负荷(P < 0.001)、体积(P=0.07)、重量(P=0.08)、密度(P=0.06)和胫骨最大负荷(P=0.06)。
3.2钙的吸收
与对照组相比，LC蛋鸡股骨中钙含量有降低的趋势(表4)，每克蛋壳中钙含量、每枚蛋壳中总钙含量和粪便中钙含量均有所降低。
低钙饲粮显著提高了钙保留率(p0.01)，但降低了绝对钙保留率(p0.05)。与对照组相比，LC蛋鸡股骨中Mg含量较低(P=0.02)，每克蛋壳中Mg含量较高(P=0.003)，但每克蛋壳中Mg总含量未分化。
低钙饲粮对股骨、蛋壳和粪便中磷含量及滞留量无显著影响。
3.3血骨转换指标及促炎因子
在测定的骨代谢参数中，LC蛋鸡的P水平低于对照组(P < 0.01，图1A)，而ALP (P < 0.01)和TRACP (P < 0.01)水平高于对照组。
低钙饲粮也增加了血浆E2浓度(P < 0.02，图1B)，但抑制了血浆促炎细胞因子IL-1 (P < 0.03，图1C)和IL-6浓度(P < 0.01)。低钙饲粮不影响LPS和D-LA水平(P > 0.05，图1D)。
3.4肠道形态变化及肠道内容物pH值
与对照饲粮相比，低钙饲粮对小肠(十二指肠、空肠和回肠)的绒毛长度、隐窝深度和绒毛/隐窝比无显著影响(P > 0.05，图2AeC)。
然而，与对照组相比，LC母鸡回肠pH值较低(P < 0.01)，盲肠pH值也可能较低(P < 0.07，图2D)。
3.5肠道细菌组成
PCoA分析显示，LC蛋鸡和对照蛋鸡的盲肠微生物群存在显著差异(p0.05，图3A)。虽然两组的盲肠相似在门水平上的微生物组成(图3B)，拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门的丰度占主导地位，而变形菌门的相对丰度与对照鸡相比有所下降，特别是在属水平上，拟杆菌门、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Phascolarctobacterium占主导地位(图3C)。
此外，在前50个细菌属中，LC组中Prevotellaceae_UCG-001、Subdoligranulum、Peptococcus和Eubacterium_hallii_group的相对丰度较高(P < 0.05)， CHKC1001和Sutterella的相对丰度较低(P < 0.05)。
肠道微生物群与肠道pH值的Spearman相关性分析显示，Prevotellaceae_UCG-001、亚doligranulum和Eubacterium_hallii_group组与回肠pH值呈负相关，而Sutterella组与回肠pH值呈正相关。Prevotellaceae_UCG-001与十二指肠pH值呈负相关(图3D)。
3.6回肠基因表达
通过DESeq2软件选择的转录，低钙饮食导致51度的2倍以上变化(P < 0.05，图4A)。
与对照组相比，LC蛋鸡的51个蛋白中有20个蛋白上调，31个蛋白下调。此外，根据Uniprot数据库，鉴定的51个DEGs中有34个已知具有编码蛋白质的功能，其中包括13个上调的DEGs和21个下调的DEGs。
氧化石墨烯分析显示，DEGs的脂肪酶G内皮型(LIPG)上调和脂蛋白脂肪酶(LIP)下调具有脂蛋白重塑功能(P < 0.05，表5)，2个下调的DEGs SLC26A3和CFTR具有通过升高pH水平调节细胞内pH代谢的功能(P < 0.05)。
KEGG分析显示，MAPK12、成纤维细胞生长因子19 (FGF19)和EPH受体A2 (EPHA2)参与Rap1信号通路(P < 0.05，表6)，特别是MAPK12和CCL4参与toll样受体信号通路和沙门氏菌感染等免疫和感染相关通路，LIPG和LIP均调节甘油脂代谢途径。
LC组CFTR、SLC26A3、MAPK12基因表达量低于对照组，SLC30A10、CHST4基因表达量高于对照组(P < 0.05，图4BeG)。
利用real - time PCR验证了参与调节肠道pH和免疫的deg。Real-time PCR分析结果与转录组测序分析结果相似，除了CCL4的相对丰度不同。
结论
本研究结果提示，饲粮缺钙时，维持血钙止血是母鸡的主要反应，其途径是降低蛋壳、骨骼和粪便中的钙含量，提高钙潴留率。
钙潴留率的升高与回肠pH值的降低、肠道基因表达的改变和肠道菌群组成的变化有关。Prevotellaceae_UCG-001、Subdoligranulum和Eubacterium_hallii_group有助于降低回肠pH值，有可能成为预防蛋鸡骨质疏松的下一代益生菌。
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