文 | 云霄钰

编辑 |云霄钰

背景

前列腺癌是美国男性癌症中最常见的非皮肤癌，也是导致男性癌症死亡的第二大常见原因。尽管PC发病率在过去25年中有所增加，但死亡率基本保持不变。前列腺特异性抗原检测作为PC筛查工具的发展导致了PC诊断的增加；然而，其中许多是侵袭性较低的病变，临床意义尚不明确。因此，临床局限性PC管理的一个中心困境是，是推迟治疗和监测，直到疾病变得更严重，以减少患者的健康副作用，还是立即治疗，以避免疾病的进展和传播。

根治性前列腺切除术或放疗治疗局部PC与高治愈率相关；然而，这与显著的副作用相关，包括尿*禁失**、勃起功能障碍和肠毒性。一般来说，PC是一种生长缓慢的恶性肿瘤，持续数十年，但侵袭性形式在一部分病例中表现出快速生长、传播和致死率。

此外，对于转移性PC患者，目前还没有治疗方法。这强调了需要新的预后工具来指导临床决策，并避免对惰性PC的过度治疗和对侵袭性疾病的治疗不足。预测肿瘤的侵袭性和进展的可能性对临床决策至关重要。PC是分级使用格里森系统，其中肿瘤与较高的格里森分数往往是更有侵略性的。

GS是通过将主要和次要格里森等级相加计算的，每个等级的范围从1到5。然而，临床局限性pc的个体GSs与那些进展为转移性疾病的之间的关系尚不清楚。PC进展过程中的致瘤事件一直难以研究，而且由于转移组织的可用性有限，缺乏表征PC进展晚期的能力。此外，60-90%的pc是多灶性，其中一个前列腺包含几个看似不相连的癌症生长位置。

多焦PC的发展仍有高度争议，两种模型已被描述为。一种理论认为，最初转化的癌症扩散到前列腺内的多个位置，而另一种模型表明，PC灶独立出现在同一腺体的不同区域。后一种选择表明侵袭性和非侵袭性癌灶可能在同一前列腺*共中**存，并得到了多灶PC的个体灶往往具有独特的GSs的支持。因此，指数病变可能不能代表PC行为，从而使分析和临床决策复杂化。因此，以前没有研究解释前列腺肿瘤的多灶性，或只使用指标病变，存在潜在的缺陷。

近年来，局部治疗被提出作为一种新的方法，仅破坏局部单灶和多灶pc的指数病变，以减少不良的健康副作用。单个PC病变的GSs，包括指数病变，在多灶性PC病变中可能存在差异，治疗决定通常基于指数肿瘤驱动PC进展的假设。因此，准确描述肿瘤或侵袭性病变是PC管理的一个基本问题。

DNA甲基化的改变发生在每种癌症类型中，重要的是，在大多数类型的癌症中，DNA甲基化水平的变化与肿瘤侵袭性相一致。表观遗传学的改变可以驱动肿瘤的发生和确定肿瘤的侵袭性，因此，可以用于诊断目的以及告知治疗方法。虽然PC已被证明具有一个巨大的遗传元素，但目前估计只有30%的这些因素在PC患者中被解释。有趣的是，最近的研究已经能够将基因改变和DNA甲基化变化联系起来，这表明DNA甲基化变化保存了一些关于基因改变的信息

在本研究中，我们从一个新的角度探讨了PC的攻击性问题。我们利用了PC的多灶倾向，并根据原发性PC灶和匹配的转移灶的DNA甲基化模式对单个PC灶的侵袭性进行了分类。在一组14例多灶性PC患者中，我们证明了超过一半的多灶性PC病例有多个亚克隆，并确定了转移病灶起源的原发性亚克隆。总的来说，我们描述了一种使用DNA甲基化标记物来识别侵袭性PC病变的独特方法，该方法在临床决策患者是否应该接受治疗或通过主动监测方面有潜在的实用价值

结果：淋巴结转移的DNA甲基化模式提示了潜在的主要病灶/病灶来源

在本研究中，我们假设侵袭性癌灶的相关甲基化程度可以识别侵袭性原发癌灶，这是侵袭性特征的代表。我们的假设依赖于四个假设： 1)多灶PC的一个子集来自独立和散发的遗传/表观遗传变化，有效地暗示不同的癌灶通过不同的分子机制/途径发展，具有独特的增殖、迁移和侵袭性潜力；2) DNA甲基化变化告知克隆进化，在传播时不会发生实质性变化；3) PC转移具有相同的克隆起源；4)盆腔淋巴结从前列腺癌中引流，可能是转移扩散的初始部位。因此，淋巴结转移，以及晚期病理阶段，构成了侵袭性特征，这是转移潜能的替代品。

为了研究DNA甲基化模式是否包含PC中克隆进化的信息，我们使用热图计算、绘制了所有样本之间的Pearson相关性和可视化。首先，与患者间AN-AN样本和患者间AN-NL样本相比，来自同一患者的主要病灶表现出更多的可变相关系数，表明部分患者存在多个癌症亚克隆，进而可能具有明显的致瘤潜能。其次，淋巴结转移与来自同一患者的一个或多个原发肿瘤病灶的相关性始终最高。

因此，DNA甲基化谱并没有分化到转移瘤和原发性肿瘤仍然具有可比性的程度。综上所述，这些结果表明，多灶pc的一个子集表现出独立的表观遗传变化，表明癌灶是由独特的亚克隆发展而来的。此外，淋巴结的DNA甲基化谱转移瘤与个别患者的病灶/病灶高度相关。

为了验证这些发现，我们利用了最近的证据，即HM450 DNA甲基化平台也可以通过汇总探针的甲基化和未甲基化信号强度来确定CNAs。该分析提供了额外的证据，表明T2和T3病灶与患者41的PL非常相似。T2和T3病灶在2、10、11、16号染色体上均有缺失，在7、8、10号染色体上均有增益，但T1和T4病灶上的这些区域没有改变，表现出不同的CNA模式。

54例患者的3例样本均有多种共同的改变，8号染色体短臂缺失，长臂扩增，两者均为PC 的共同特征。54例患者的3例样本均有多种共同改变，8号染色体短臂缺失，长臂扩增，两者均为PC的共同特征。总的来说，CNA分析支持了我们基于DNA甲基化分析的患者41多亚克隆来源和患者54多单克隆来源的发现。此外，CNA的结果也支持了我们的发现，即淋巴结转移的起源可以通过DNA甲基化数据来确定。

开发了一组DNA甲基化标记物作为PC攻击性的分类器

接下来，我们设计了一种基于DNA甲基化的PC侵袭性分类器，将原发性PC灶分为侵袭性和非侵袭性。无监督分层聚类方法有效地识别了淋巴结转移的主要来源；然而，为了以定量、无偏和客观的方式对单个病灶的侵袭性进行分类，我们使用所有过滤后的HM450探针计算了患者内任何两个样本之间的欧氏距离。

欧几里德距离，如皮尔逊相关，比较样本相似性，但保持数据可变性，也优于分析差异基因表达分析我们将所有原发肿瘤病灶的欧几里德距离范围划分为离散类别。由于这种分类方法的目的是将真正侵袭性和非侵袭性肿瘤组用于生物标志物的开发，我们纳入了10个欧几里德距离单位，以减少错误分类的风险。使用基于DNA甲基化的系统发育树显示了每个患者的样本分类，其中样本是攻击性的颜色。

综上所述，我们开发的分类方法发现8例患者显示出独立的DNA甲基化谱，表明有多个亚克隆。5例患者表现出相似的DNA甲基化模式，表明为单克隆起源，1例患者被归类为未确定。这些发现与无监督的聚类数据一致，除了患者88，他们没有显示热图和树状图显示的离散亚克隆。在该患者中，前1%最可变的甲基化探针不能代表潜在的克隆关系。

癌症基因组图谱PC队列验证了我们的侵袭性分类器的潜力

为了在一个独立的数据集上测试分类器，我们利用了公开可用的前列腺腺癌HM450 DNA甲基化数据以及来自癌症基因组图谱项目的相关临床信息。我们使用该分类器检测了496个前列腺样本。对于每个样本，正常组、攻击性组和非攻击性组的概率之和为1，概率最高的组是给定样本的预测表型。在TCGA PRAD样本中，70%的预测概率大于0.67。

在39例AN前列腺TCGA样本中，38例预测为正常，1例预测为侵袭性。312年原发肿瘤，233年预测为侵略性，67预测为非侵袭性，12预测为正常，从而导致97.4%的特异性和96.2%的癌症敏感性电脑相比组织样本。根据TCGA进行的组织显微镜检查评估我们的预测与样本诊断之间的一致性，分类器的预测阴性值为76%，99.7%。高GSs的优势和晚期T3-T4TCGA PRAD肿瘤的分期可能解释了预测为侵袭性的癌症的高比例。事实上，我们确实发现这个结果加强了我们的分类器的有效性。

讨论

识别PC侵袭性是改善诊断为器官局限性PC的患者关于治疗或主动监测的临床决策的基础。通过实施我们的研究设计，检测原发性多灶PC和匹配的淋巴结转移中的DNA甲基化，我们能够检查原发灶之间的关系以及原发灶和转移之间的关系。重要的是，我们发现在我们的队列中，超过一半的患者显示了多个亚克隆，结果与之前报道的研究相似，而且淋巴结转移的DNA甲基化类似于来自同一患者的癌变病灶/病灶。

利用这些发现，我们开发了一种方法来分类亚克隆的关系和侵袭性。所得到的攻击性和非攻击性样本组，以及邻接的正常样本，被用于寻找生物标志物来区分三组，结果是一个25个探针的攻击性分类器。分类器显示当它应用于来自TCGA的PC队列样本时，具有良好的预后潜力，值得在未来的研究中进行验证，包括对患者的纵向监测。

在这项研究中，我们依赖于DNA甲基化可以告知克隆进化的假设。一些研究已经通过高精度的解决了DNA甲基化和克隆进化之间的联系，最近，科斯特洛和同事报道，系统表观遗传关系有力地再现了胶质瘤及其复发的系统发育模式。在我们的队列的14个患者中，有11个有两个或多个病灶来自同一亚克隆，表明最初的亚克隆通过迁移在多个位置播种。我们不能明确地排除这些实际上不是一个大的或分支的焦点，因为在一个精细的物理连接很难在病理样本中清楚地区分。因此，我们不试图确定来自同一亚克隆的哪个焦点产生了PL。

虽然临床工具和技术已经有了巨大的改进，但在物理表现之前对肿瘤侵袭性的确定必须依赖于生物化学或分子水平上测量的生物标志物。成功的一个障碍是如何根据临床终点来定义肿瘤的侵袭性。通常GS或PSA复发的时间被用作PC侵袭性的替代物，这将更适合地使用转移进展性或死亡率进行评估。在这项研究中，我们使用了一种新的方法来将侵袭性定义为引起淋巴结转移的能力。淋巴结转移的存在表明肿瘤细胞已经获得了离开原发部位并在继发部位增殖的能力，从而作为癌症建立远处转移能力的指标。

除了这种类型的淋巴播散外，转移也可以通过血行播散发生到脑、肺、肝和骨髓。在转移性PC的治疗期间，这些部位的继发性癌生长不会被常规移除，因此，用于研究的组织直到死后才可获得。虽然我们认识到远处转移并不仅仅通过淋巴播散发生，但我们表明这个临床终点非常相关或与其他临床病理参数一致相关。

格里森评分7肿瘤是临床决策中最困难和最糟糕的背景之一；然而，我们的研究表明，使用我们的分类器使用GS 7的pc的侵袭性与病理肿瘤分期高度相关，但对原发或继发格里森模式没有特异性。因此，我们的分类器可能会挑战目前的临床护理标准，并可能导致对选定的PC患者进行主动监测和避免不必要的侵入性治疗。

本研究的一个局限性是，我们的发现集实际上只有14名患者，其中我们总共有79个样本。一个更大的发现集将改进研究，并由于巨大的PC异质性，可能导致分类器扩大到超过25个探针。尽管发现集的规模不大，但我们能够验证攻击性分类器，因此，我们的研究方法使用了来自496个初级组织的公开获得的TCGA PRAD DNA甲基化数据。在将我们的预测与TCGA临床病理信息相关联后，我们发现侵袭性与术前PSA水平、病理GS、淋巴结转移和肿瘤分期之间存在显著相关性；但有趣的是，我们没有发现与肿瘤大小有任何相关性。我们确实认识到，不同的临床终点会更好

然而，适合描述不良的临床结果，但遗憾的是，TCGA PRAD队列的平均随访期仅为3.16年。因此，我们发现复发的患者太少，因此只发现两组间的肿瘤状态存在显著差异。综上所述，所提供的数据表明，与目前使用的任何方法相比，使用DNA甲基化数据可以更具体地识别侵袭性病变的新颖性，并且由于其在PC活检标本早期检测方面的潜在临床应用而尤其有前景

如果怀疑是PC，则将前列腺活检作为PC诊断的标准护理方法。目前，前列腺穿刺活检最常见的方法是以系统的、随机的形式经直肠进行。这种系统的随机活检策略有很高的误诊率，因为非靶向针可能错过临床显著的癌症病灶，只捕获临床不显著的癌症病灶，或完全错过所有癌症病灶。因此，传统的系统性、随机前列腺活检的显著采样误差使得它们在准确表征肿瘤的指标位置、体积和GS 方面不可靠。

最近开发的图像引导靶向前列腺活检技术，融合了磁共振和三维经直肠超声图像，可以可靠地识别指数病变的位置和主要的格里森模式。通过结合图像引导的靶向活检和我们的DNA甲基化分类器，我们期望提高识别侵袭性灶的能力，并随后更准确地描述活检检测到的PC灶。

确定侵略性的能力活检样本映射到一个特定的前列腺位置也有伟大的承诺更明智的临床决策选择积极监测非积极的PC焦点和手术或有针对性的焦消融治疗积极的PC焦点，尽管应该注意的是，几个步骤仍然批准临床使用。最初，攻击性分类器应该发展成为一种以自定义DNA甲基化阵列或多路pcr分析的形式进行的更经济和劳动效益的测试。此外，在最终在临床试验环境中进行检测之前，该检测应该在回顾性收集的样本——前列腺活检、血液或尿液样本中进行广泛的临床验证。

结论

我们的研究证明了转化医学的相关性，从收集的PC样本和大规模数据集到具有潜在临床适用性的DNA甲基化生物标志性面板。