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禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的一种损害呼吸系统的传染性疾病。

AIV基因组由单股RNA组成，分8个节段，编码10个基因，其中第4节段RNA编码血凝素（Hemagglutinin,HA），其蛋白是位于流感病毒囊膜表面的糖蛋白，是AIV基因表达产物最典型的Ⅰ型糖蛋白，主要功能是与表面受体结合，介导病毒与细胞内体膜融合。

感染性AIV致病性的高低某种程度上取决于HA裂解位点附近碱性氨基酸的数量。

自1999年宁夏中卫首次报道发生H9亚型禽流感疫情以来，AIV普遍存在于活禽市场以及规模养禽场中。

目前，对宁夏地区H9亚型AIV生物学信息研究较少，跨物种传播能力尚不清楚。

本试验对宁夏地区H9亚型AIV HA基因进行遗传进化、关键氨基酸位点分析及与人源H9亚型AIV的对比分析，系统阐述宁夏地区H9亚型AIV的生物学特性，为H9亚型AIV的监测与防控提供理论基础和数据支撑。

材料与方法

试验材料

样品来源

2022年4—6月在宁夏平罗县、贺兰县、青铜峡市、原州区、西吉县、沙坡头区等6个养禽集中地的活禽市场以及规模禽场中随机采集禽类咽喉/泄殖腔拭子共1 240份，其中鸡1 096份、鸭66份、鸽66份、鹅10份、雁2份。

同一只家禽的咽喉/泄殖腔拭子样品置于同一2 mL离心管中，离心管内装有1 mL青霉素（10 000 U/mL）与链霉素（10 000μg/mL）的双抗PBS采样溶液，样品采集后保存于-80℃冰箱。

主要试剂

磁珠法病毒RNA提取试剂盒购自西安天隆公司；禽流感病毒/新城疫病毒二重核酸检测试剂盒（批号：7F137,AIV检测基因：M基因，新城疫病毒检测基因：P基因）、禽流感病毒（H5/H7/H9）三重核酸检测试剂盒（批号：7F138,H5/H7/H9亚型AIV检测基因均为HA基因）均购自深圳澳东检验检测科技有限公司；DL2000 DNA Maker（批号：AL61420A）和PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2(DyePlus）（批号：ALF2554A）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）。

主要仪器

紫外凝胶成像仪（Universal HoodⅡ）为美国伯乐公司产品；荧光定量PCR仪（QuantStudio5型）为赛默飞世尔科技公司产品；基因扩增仪（PCT200型）为美国伯乐公司产品；电泳仪（DYY-2C型）、电泳槽（DYYCP-31C型）均为北京六一生物科技有限公司产品；高速冷冻离心机（5424型）为德国艾本德公司产品。

试验方法

荧光检测

对采集的1 240份样品使用磁珠法分别提取RNA，使用禽流感病毒/新城疫病毒二重核酸检测试剂盒、禽流感病毒（H5/H7/H9）三重核酸检测试剂盒检测H9亚型AIV，根据试剂盒说明书，在阴阳性对照条件成立下将具有特异性曲线且Ct值<37的样本判为阳性。

H A基因扩增与测序

反应体系：酶M i x:2μL,2×Buffer:25μL,Forward peimer:2μL,Rervese peimer:2μL,ddH2O:15μL,AIV RNA:4μL，反应体积为50μL。

扩增产物使用1.5%凝胶电泳进行鉴定，目的条带大小约为1 772 bp，阳性扩增产物送至北京华大基因公司进行测序。

序列分析

HA基因测序后，结果显示阳性样品中H9亚型阳性样品10份、H3亚型阳性样品5份、H6亚型阳性样品1份，本试验仅对H9亚型AIV进行基因演化分析。

将测序得到的H9亚型AIV序列分别命名为A/Chicken/Ningxia/1/2022～A/Chicken/Ningxia/10/2022，简写：A/NX1～A/NX10，将测序结果上传至NCBI数据库。

在NCBI数据库中将测序基因与我国具有代表性的H9亚型毒株基因序列进行比对，对关键氨基酸位点进行分析，利用Megalign软件分析核苷酸和氨基酸同源性，利用MEGA 7.0软件绘制系统进化树。

结果与分析

荧光检测结果

使用禽流感病毒/新城疫病毒二重核酸检测试剂盒对样本进行检测，发现1 240份咽喉/泄殖腔拭子中阳性样品122份，样品总AIV阳性率为9.84%。

采用禽流感病毒（H5/H7/H9）三重核酸检测试剂盒对122份AIV阳性样品进行检测，发现94份样品为H9亚型阳性样品，H9亚型阳性率为7.59%。

RT-PCR检测结果

对H9亚型AIV阳性样本进行HA基因RT-PCR电泳检测，发现有16份样品出现大小约为1 772 bp的目的条带。

将HA基因阳性样品测序后，发现阳性样品中有H9亚型阳性样品10份、H3亚型阳性样品5份、H6亚型阳性样品1份。

HA基因序列特征

将H9亚型AIV测序结果分别命名为别命名为A/Chicken/Ningxia/1/2022—A/Chicken/Ningxia/10/2022，简写：A/NX1—过对A/NX1—A/NX10，并上传至NCBI数据库。

通过对A/NX1～A/NX10进行氨基酸关键位点分析，发现HA蛋白裂解位点序列为333PSRSSR338，无连续碱性氨基酸的插入，符合低致病性禽流感病毒的特征；受体结合位点左侧缘均为NGLMGR，均发生Q234L突变，具有人源流感病毒特性；糖基化位点中发现有218～220位点缺失和313～315位点增加；同时，HA蛋白具有6个糖基化位点29NST31、141NVS143、298NTT300、305NVS307、313NCS315、492NGT494，序列均为不完全序列。

遗传进化与抗原位点分析结果

在NCBI数据库中，将10个H9亚型AIV HA基因（A/NX1～A/NX10）与我国不同地区的禽类H9亚型毒株基因序列进行序列比对，并采用MEGA 7.0构建系统发育树（N～J），发现10个HA基因（A/NX1～A/NX10）均属于H9.4.2.5分支（。

抗原位点分析显示，T147、N166、D207抗原位点保守性较强，其余位点均有不同程度变异。

HA基因遗传进化树 注：A/Chicken/Ningxia/1/2022～A/Chicken/Ningxia/10/2022为本试验扩增所得H9亚型AIV序列；其余为参考毒株。

HA基因序列与人源H9亚型AIV HA基因核苷酸同源性比对结果

本试验序列与人源H9N2亚型AIV HA基因核苷酸同源性较高，同源性可达91.7%～98.5%。

宁夏6个县（市、区）禽咽喉/泄殖腔拭子样品检测结果

HA基因RT-PCR扩增结果 HA基因RT-PCR扩增结果 注：M:DL2000 Marker;1、16为阴性对照；2—15、17—18为AIV阳性样品扩增产物注：M:DL2000 Marker;1、16为阴性对照；2～15、17～18为AIV阳性样品扩增产物。

自1994年我国首次分离到H9亚型AIV至今，AIV已经在我国流行30多年，经历了由BJ/94-like→F/98-like→Y280-like的演化，当前国内主要流行的H9亚型AIV均属于H9.4.2.5分支（Y280-like)。

本试验遗传进化结果显示，宁夏地区H9亚型AIV HA基因符合低致病性禽流感病毒的特征；系统发育树显示，A/NX4/99与H9.4.2.5代表株A/Duck/HK/Y280/97同源性较高。

从样本中分离出的H9亚型AIV HA基因与人源H9亚型AIV核苷酸对比发现，同源性达到91.7%～98.5%，说明宁夏地区H9亚型AIV感染人的风险较高。

据2021年报道，新型H3N8病毒重配对鸡群造成极大损失，其内部基因由H9N2病毒提供。

2022年报道的人源H3N8病毒内部基因也是由H9N2内部基因所提供，以上研究说明应继续加强对H9亚型AIV的持续监测。

A/NX1～A/NX10 HA蛋白裂解位点氨基酸位点序列均为PSRSSR非连续性的碱性氨基酸排列方式，符合H9亚型AIV低致病性禽流感特征，其裂解位点通常只有1个碱性氨基酸（精氨酸/赖氨酸）（R/K）插入，识别并裂解这种结构的精氨酸，蛋白酶分布在消化道与呼吸道的上皮细胞内，机体感染时病毒在消化道与呼吸道内增殖，表现为轻微感染症状。

且A/NX1～A/NX10 HA蛋白均发生Q234L突变，具有和人流感受体唾液酸α-2,6-受体结合特性。

早期流行病学显示，H9亚型中Q234与L234并存，但近期研究发现H9亚型分离株几乎不出现L234突变。

TDT149N、N201T突变表明病毒已适应宿主或在接种过程中逃逸，226位点均含G（甘氨酸）可以表现出人型受体结合特性。

HA受体结合位点中198(V/T/S/L)、168(N/A/S/E/D/F)位点与病毒力密切相关，说明位点突变可能会使病毒亲和力显著增加，与禽流感疫苗接种后在宿主体内诱导的逃逸免疫防御机制密切相关。

381位点均存在赖氨酸（K）是有利于气溶胶传播H9亚型禽流感的关键氨基酸位点。

AIV的HA蛋白通常有5～11个糖基化位点，其数量与位置是决定AIV致病力、抗原性以及毒力的影响因素，HA蛋白附近增加糖基化位点会阻断蛋白酶的裂解和病毒感染。

本试验中糖基化位点表现出218位点的缺失及313位点的增加，可能导致病毒传播能力和复制能力增强。

与疫苗株A/Chicken/Sh/F98相比，本研究中T147、N166、D207抗原位点保守性较强，其余抗原位点均发生不同程度的变异（G92R/K、S145D、D153G、Q164R、N167G/D、A168N、D196E、T197D、T200R、N201T），可能会导致目前使用的H9N2亚型AIV疫苗免疫失败。

本研究通过对宁夏地区H9亚型AIV HA基因的遗传进化关系、关键氨基酸位点以及与人源H9N2亚型AIV进行核苷酸同源性分析，发现宁夏地区H9亚型AIV属于我国主要流行分支（H9.4.2.5），均存在Q234L突变，与人源H9N2亚型AIV同源性较高，具有跨物种传播能力，且毒力和致病力等生物学特性有趋于转强的可能性，HA基因持续变异，经过基因重排可能进化出新的禽流感亚型或分支，威胁公共卫生安全。

因此，在禽类养殖过程中，必须对H9亚型AIV加以重视并加强预警，严格做好监测防控工作。

《2019—2020年河北省部分地区鸡H9N2亚型禽流感HA基因和NA基因遗传进化分析》

《禽流感病毒致病机制研究进展》

《禽流感病毒血凝素基因研究进展》