糖尿病肾病（Diabeticnephropathy,DN）是糖尿病的主要微血管并发症，也是终末期肾脏疾病的主要病因。
细胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs）包括外泌体，微粒和凋亡小体，是纳米、微米大小的膜性囊泡，内含诸如蛋白质、核酸、脂质等生物活性因子，参与细胞间的信息传递。 近期研究表明，EVs参与了DN的病理生理过程。
在美国等发达国家以及许多发展中国家，糖尿病肾病（Diabeticnephropathy,DN）已经成为慢性肾脏病（Chronickidneydisease,CKD）的主要病因之一， 约一半以上的终末期肾病（End-stagerenaldisease,ESRD）是由DN所致。
流行病学研究发现，2015年，全球总共有4.15亿人口罹患糖尿病，500万人死亡，全球卫生支出总额为6730亿美元。 预计在2040年，糖尿病的发病率将达到6.42亿，其中约30%-40%的患者将并发DN。
因此，对DN的发病机制进行进一步探索，以获得更高效的治疗方案，具有重要的科学价值和社会意义。 细胞外微囊泡（Extracellularvesicles,EVs）是一个广泛的概念，包括各种机制下细胞释放到细胞外环境中的所有膜性囊泡。
在细胞间通讯、组织稳态、细胞分化以及器官发育和重塑中发挥着重要作用。 根据其大小和产生方式的不同，EVs目前主要分为三个亚类：外泌体（exosomes）、微粒（microparticles,MPs）和凋亡小体（apoptoticbodies）。
外泌体是最小的EVs，直径30-100nm，在多囊泡的核内体或多泡体（Multivesicularbodies,MVBs）中产生， 当这些腔室与细胞质膜融合时分泌，因此含有丰富的核内体来源的成分。MPs是直径100-1000nm的球形囊泡，直接在细胞表面以出芽的方式释放。
由表面磷脂双分子层和丰富的内容物组成（包括mRNA、miRNA、非编码RNA、蛋白质、生物活性脂质、信号核苷酸和代谢产物等）。 凋亡小体直径约1-5μm，在细胞裂解时被释放。几乎所有的细胞类型均能产生EVs。
并分布血液、脑脊液、母乳、唾液、尿液等多种体液中。 在泌尿系统方面，研究表明，肾单位不同组分分泌的EVs均参与肾脏的病理生理过程， 同时，血浆中、间充质干细胞、泌尿干细胞、癌细胞以及巨噬细胞来源的EVs也参与了肾脏疾病的进展。
EVs在肾脏中的生理作用
肾脏是人体的重要器官之一，具有稳定内环境，调节水、电解质和酸碱平衡以及内分泌的功能。 肾小球滤过膜是肾脏发挥滤过功能的结构基础，由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞构成。
肾小球滤过膜可防止循环中的EVs进入肾单位管腔中， 由此，循环中的EVs主要通过刺激面向血管腔的细胞（诸如血细胞和内皮细胞）和免疫细胞，在肾脏的信号传递过程中起作用。 而肾单位管腔中参与肾脏生理过程的EVs，主要来源于面向肾单位管腔的所有类型的上皮细胞。
对尿液中EVs携带的特定的蛋白质、mRNA和miRNA进行分析可得出其来源细胞。 例如，足细胞来源的EVs可表达膜蛋白podocin和足细胞标志蛋白podocalyxin，而来源于近段小管上皮细胞的EVs可表达蛋白megalin和cubilin以及氨肽酶aminopeptidase。
水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP-1）的表达同样ᨀ示来源于近段小管上皮细胞。 携带糖蛋白（Tamm-Horsfallprotein,THP,一种正常尿液中的富含的聚合蛋白）、CD9和2型Na-K-2Cl共转运蛋白的EVs来源于Henle’s袢的上行肢。
而AQP-2和粘蛋白-1（mucin-1）的表达表明EVs起源于集合管，CD133阳性的EVs则是起源于肾祖细胞(37)。 在RNA水平上，通过Ⅰllumina基因组分析尿液中EVs的核酸序列，发现绝大部分RNA属于核糖体RNA和非编码RNA。
而其余RNA编码了肾单位、集合管、膀胱和前列腺全段的特异性蛋白， 再次证明尿液中EVs来源于整个泌尿系统。近年来研究者对EVs在肾脏中的生理作用不断探索，具体归纳如下。
清除代谢废物
细胞可通过释放EVs，清除其过量的或衰老的蛋白质和脂肪， 以达到清除细胞内代谢废物的目的，这是一种比蛋白酶体和溶酶体降解更为高效的方法。
细胞间信号传导
细胞释放的EVs可能通过以下三种方式在细胞间信号传递中发挥效应： 1.EVs通过表面的粘附分子和受体与靶细胞特异性结合，致使靶细胞的受体以及下游信号激活； 2.EVs可直接与靶细胞融合，将mRNA，miRNA，蛋白质以及信号分子等直接转移到靶细胞中；
3.EVs被靶细胞内吞，其内容物通过胞内途径处理后进入靶细胞。 研究证实，尿路上游细胞（如足细胞和肾小管上皮细胞）产生的EVs可被下游细胞（如集合管上皮细胞）所摄取，影响受体细胞的功能。
首先，小管上皮细胞和足细胞产生的EVs含有丰富的CD24 ——这种小型糖基磷脂酰肌醇锚定分子可促进细胞之间的粘附和信号传导。其次，EVs可通过初级纤毛与受体细胞特异性的相互作用。
此外， 尿液中的部分分子可影响受体细胞对EVs的摄取，例如THP可限制EVs与细胞的融合。 这些研究均从侧面证实了EVs可被下游细胞所摄取。同时，研究证实，AQP-1和产铵的谷氨酰胺酶（ammonium-generatingenzymeglutaminase）是近段小管上皮细胞的典型蛋白。
而这两种蛋白也可通过EVs传递至下游细胞，在远端小管上皮细胞和集合管上皮细胞中表达。 并且，远端小管上皮细胞和集合管细胞摄取近端小管分泌的EVs后，其产生的基础活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）将会明显减少。
这些证据均直接证实足细胞和肾小管上皮细胞产生的EVs，可被集合管上皮细胞所摄取， 从而实现细胞间的信息传递。
调节离子转运
通过传递信号，EVs可调节受体细胞对离子的转运。 研究发现，近段小管上皮细胞来源的EVs携带有活化的糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glycolyticenzymeglyceraldehyde-3-phophatedehydrogenase,GAPDH）。
这些活化的GAPDH可通过降低远端小管和集合管通道的开放率，降低上皮细胞钠通道的活性，调节钠离子的转运。 EVs也可在集合管上皮细胞间传递信息。证实，去氨加压素（一种合成的抗利尿激素类似物）可刺激集合管细胞摄取EVs。
而这些刺激后的集合管细胞可通过释放EVs，调节未受刺激的集合管细胞中水通道蛋白-2（Aquaporin2,AQP2）的表达和液体转运。 此外，EVs自身富含的血管紧张素转化酶也可通过肾素-血管紧张素系统调节受体细胞的液体平衡。
调节肾脏免疫
EVs同样被证实具有调节肾脏免疫的作用。 早在2009年，首次证实了人支气管上皮细胞分泌的EVs可通过中和作用抵抗人流感病毒。
在对尿液中的EVs进行深入的蛋白质组学分析和电镜观察分析后也发现， 正常人体尿液中的EVs富含先天免疫蛋白（包括抗菌蛋白和多肽等），能有效抑制致病性和共生性大肠埃希菌的生长，并诱导细菌溶解。
此外，尿液中的EVs也可通过表达组织因子（tissuefactor,TF）， 促进凝血，减少失血，并降低微生物进入人体中，促进宿主免疫。
促进肾脏发育和再生
EVs还可通过介导上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用在肾脏的发育和再生中发挥关键作用。 在肾脏发生和肾脏胚胎发育的过程中，肾小管上皮细胞可通过激活间充质-上皮细胞转化，诱导间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）中的上皮结构。
使肾后间质形成管状上皮结构。 上皮的分化主要由肾小管上皮细胞来源的EVs所介导，肾小管上皮细胞来源的EVs可通过携带的miR-200家族促进骨髓来源的MSCs发生间充质-上皮细胞转化。
综上所述， EVs在健康肾脏中发挥着清除代谢废物、传递细胞间信号、调节离子转运、调节肾脏免疫、促进肾脏再生和分化等作用，参与了正常的肾脏生理代谢过程。
EVs在DN诊治中的作用作为生物标志物
与传统的血液和尿液来源的生物标志物相比较，尿液来源的EVs携带有丰富的内容物， 并且EVs本身的脂质双分子层可使其内容物免于降解。同时，EVs可稳定的长期储存和反复冻融。
因此，近期研究也致力于通过蛋白组学、脂质组学、代谢组学以及全面的基因组分析， 运用高级系统生物学算法，探索尿液EVs及其内容物是否可作为早期DN诊断或进展期肾功能评估的生物标志物，以利于预防或延缓DN进展。
临床上，对DN患者尿液EVs进行蛋白质组学分析后共鉴定出352个与人类尿液EVs相关的蛋白， 将其与健康对照组比较分析后，发现三种与DN相关的蛋白。
其中微球蛋白（alpha-1-microglobulin,AMBP）和组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶（isoform1ofhistone-lysineN-methyltransferase,MLL3）在DN患者尿液EVs中升高， 而电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（Voltage-dependentanion-selectivechannelprotein1,VDAC1）在DN患者尿液EVs中表达降低。
此外，在对DN患者尿液EVs进行ELISA和Westernblot独立分析后发现， 水通道蛋白AQP-5和AQP-2在DN患者尿液EVs中均明显升高，并与DN的病理分型成正相关。
在miRNA谱方面，应用定量实时聚合酶链式反应（quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qPCR）分析STZ诱导的糖尿病大鼠尿液EVs中RNA的水平以及肾脏病理染色发现， miR451-5p随糖尿病的进展表达不断增加，且可预测肾脏损伤。
对DN患者尿液EVs中的miRNA进行AgilentsmiRNA微阵列分析后发现了14种miRNAs（miR-320c,miR-6068,miR-1234-5p,miR-6133,miR-4270,miR-4739,miR-371b-5p,miR-638,miR-572,miR-1227-5p,miR-6126,miR-1915-5p,miR-4778-5p,miR-2861）均在DN患者中明显升高， 而另两种miRNAs（miR-30d-5p和miR-30e-5p）明显下降。
通过PCR分析证实，尿液EVs中的miR-15b，miR-34a以及miR-636在DN患者中表达增加。 此外，作者还发现，miR-133b，miR-342以及miR-30a也在DN患者尿液EVs中表达增加，且与糖化血红蛋白、收缩压、低密度脂蛋白、血肌酐水平、尿白蛋白排泄率以及肾小球滤过率相关。
尿液EVs中包含的WT-1蛋白水平（Wilmstumor-1，WT-1,一种特征性的肾小球足细胞蛋白）同样可预测DN患者中肾小球滤过率的水平。 尿液来源的EVs能否成为DN的生物标志物仍存在重大挑战。
包括分离方法标准化、研究之间的重现性，以及仍需要更大的队列研究进一步证明， 但可以期待，尿液EVs极有可能作为一种无创的检测方法，用于DN的早期防治和病情评估。
作为药物载体工具
近年来，由于EVs的低免疫原性，在循环中的稳定性，以及其可在组织中浸润并通过受体-配体相互作用向靶细胞特异性传递内容物的特性， 人们深入的探究了EVs作为药物运载工具的可能性。
真核生物基因蛋白质、小干扰RNAs、miRNA、脂质和特定的药物等均通过基因工程技术，成功的载入到EVs中， 通过靶向脑细胞、免疫细胞以及肿瘤细胞等，展示出治疗阿尔兹海默病、帕金森、实体肿瘤等疾病的潜力。对于DN，EVs也有望成为一种新的治疗方式，通过药物的传递，实现疾病的缓解。
肾脏再生治疗
多个临床前实验均证明MSCs来源的EVs可通过抑制细胞凋亡， 促进肾小管细胞增殖，从而诱导肾脏再生和修复。
在高脂饮食或STZ诱导的DN大鼠肾脏局部注射MSCs来源的EVs后，EVs可通过抑制TGF-β1的表达， 改善肾小管扩张，减少肾小管上皮细胞的空泡形成和萎缩，并且减少炎症细胞的浸润，最终抑制肾脏纤维化。
与此一致的是，发现MSCs来源的EVs可通过自身携带的miRNA，靶向肾组织的纤维化相关基因， 介导纤维化基因表达下调，进而降低血肌酐和尿素氮水平，减少尿白蛋白排泄，延缓疾病进展。
此外，MSCs来源的EVs也可通过雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）信号通路，诱导自噬，显著改善肾脏功能和肾脏纤维化。 体外研究中，MSCs和人肝细胞来源的EVs可通过转运miR-222，致使肾小球系膜细胞中STAT5表达下调，miR-21含量减少。
TGF-β的表达和基质蛋白的合成降低，并恢复系膜细胞中线粒体电子传递链成分的表达，最终改善高糖诱导的系膜细胞损伤。 干细胞来源的EVs也被证明对DN具有治疗作用。脂肪组织干细胞（Adipose-derivedstemcells）分泌的EVs可通过自身携带活化的STAT3，反式激活精氨酸酶-1（arginase-1），诱导巨噬细胞分化为抗炎M2表型。
这样诱导形成的M2巨噬细胞不仅高表达酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase），同时可促进脂肪组织干细胞的增殖和乳酸生成， 进而促进白色脂肪组织在体内的平衡，改善胰岛素敏感性，减少肥胖和肝脏脂肪变性，进而治疗糖尿病。
尿液干细胞来源的EVs（Exosomesfromurine-derivedstemcells,USCs-Exo）可通过抑制足细胞凋亡， 促进血管再生和细胞存活，从而预防糖尿病肾损伤。
在糖尿病大鼠中静脉输注USCs-Exo后，大鼠尿量和尿微量白蛋白排泄均减少，足细胞和肾小管上皮细胞凋亡得到改善， 细胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）的表达被抑制，并促进肾小球内皮细胞的增殖。
体外实验也证实，USCs-Exo可减少高糖所致的足细胞凋亡。 以上现象可能与USCs-Exo内含的生长因子、TGF-β1、血管生成素（angiogenin）和骨形态蛋白-7（bonemorphogeneticprotein-7）等因子相关。
总之，EVs在DN诊治方面具有巨大的潜力。EVs可作为一种无创的生物标志物用于DN的早期诊断；EVs也可作为药物载体，延缓疾病进展。目前应用EVs治疗DN已在基础研究方面取得了极大的突破，但仍需要大量的临床研究和大样本队列研究验证之后，才能用于临床治疗。
