文|孤寒江雪
编辑|孤寒江雪
引言
铜绿假单胞菌是一种常见的环境细菌，广泛存在于土壤、水体和生物膜等环境中，这些不同的生境条件会导致细菌面临不同的氧化还原条件，本文研究的目的是通过实验观察和分子生物学分析，探究铜绿假单胞菌在不同氧化还原条件下小菌落变异的特点和机制。
研究表明，细菌在氧化环境中形成大菌落，而在还原环境中则形成小菌落，进一步的实验发现，氧化环境下细菌形成的大菌落有利于其生存和生长，而在还原环境下形成小菌落有助于其在压力下更好地存活。
铜绿假单胞菌SCV与生物膜
铜绿假单胞菌的SCV是在促进生物膜形成的培养条件下获得的，即使在14小时后，并且在气液界面处没有形成薄膜，当PA14作为站立培养物生长48小时时，SCV很容易自发出现，为了确认获得的菌落确实是SCV。
而不仅仅是小菌落，我们进行了特定的表型表征，获得的菌落具有明显小于其WT对应物的尺寸，表现出增强的生物膜形成，过度产生c-di-GMP，并且过度纤毛，这些结果证实，14小时后PA48站立培养物中出现的小菌落确实是SCV，由于在立式培养物，这些结果表明SCV是在促进生物膜形成的条件下出现的。
接下来，我们询问生物膜促进条件是否是SCV出现的唯一原因，或者是否可能涉及额外的环境压力，激越培养物和站立培养物之间的关键区别是O2在液体内分布，我们研究了O的作用2通过培养铜绿假单胞菌PA14在微需氧条件下的这种现象。
引人注目的是，表面形成了一种更加疏水性和坚固的薄膜，如用塑料尖端，事实上，39小时有氧站立培养的总人群中有48%是SCV，而当环境O2浓度降低，即在微需氧条件下，SCV达到总人口的50%，由于微需氧条件促进更高的SCV比例和SCV具有高度疏水性，这一结果证实了薄膜的形成与SCV的发病率直接相关。
进一步验证O之间是否存在链接2培养物中SCV的可用性和发病率，我们将刃天青染料添加到5mL站立培养物中，染料早在接种后6小时就变成粉红色，表明O2迅速被细菌消耗，孵育48小时后，O2如大多数培养物中的无色刃天青所示，大部分被耗尽，并且仅在表面被氧化。
这表明O2被细胞迅速消耗，只有表面细胞才能获得显着的O2，有趣的是，SCV在孵育开始后24小时就形成了整个种群的很大一部分，伴随着观察到显着的浊度并且在完成O之前，2耗竭，SCV在总种群中的百分比在孵育48小时后达到最大值。
当O2几乎完全耗尽，由于O214小时后，扩散仅限于PA48立式培养物的表层部分，我们从立式培养物的顶部到底部取样1mL级分并定量SCV，SCV在上部三个部分占总人口的~30%，其中刃天青仍然被氧化，但在较深的部分15至4，SCV主要存在于表面，其中O2仍然可以检测到，并且在O2已耗尽。
由于SCV促进有效的生物膜生长，我们假设SCV在功能上是选择的，因为它们很容易在气液界面形成薄膜，通过提供更直接的进入大气O的通道，允许种群快速适应电子受体限制2.支持这一假设，铜绿假单胞菌PA14主要以薄膜的形式生长在O2-限制条件，薄膜下几乎看不到浊度。
在立式培养物有效生长之前观察到~20小时的滞后阶段，这也是首次检测到SCV和在站立培养物中可见出现薄膜之前观察到的时间，表明在观察到的滞后阶段，最初对次要的SCV亚群进行强烈正选择以克服由O引起的生存压力2限制，这些结果表明，对O的访问受到限制2代表在铜绿假单胞菌培养物中切换到SCV表型的强大选择压力。
电子受体的存在减轻SCV压力
我们接下来想确定选择是否由异质O引起2在PA14常备培养物中的分布确实是SCV出现和薄膜形成的原因，这是通过添加替代电子受体硝酸盐到站立的文化，以便O2不再是初级电子受体支持我们的假设。
在存在KNO的情况下没有观察到明显的薄膜3，只有薄而脆弱的薄膜，这种残留的薄膜与在没有硝酸盐存在的情况下观察到的粘性厚薄膜完全不同，使用KNO3补充，培养基浑浊，表明培养物内的生长是均匀的，并且不再像在没有添加KNO的情况下观察到的那样主要局限于表面。
引人注目的是，在补充了KNO的站立培养物中几乎无法检测到SCV3 ，表明均相可用的电子受体的存在阻止了SCV的出现，Anr是主要的O2铜绿假单胞菌的调节剂，由低O激活2控制反硝化基因表达的条件，允许使用硝酸盐作为电子受体，铜绿假单胞菌和突变体不再能够使用硝酸盐作为O2替代电子受体。
在KNO中生长的铜绿假单胞菌PA14 anr−突变体之间的SCV水平相似3-补充培养基和PA14WT生长没有KNO3补充，这些结果表明，当2克服了局限性，消除了在表面以薄膜形式生长并因此切换到SCV表型的压力。
这与在充分搅拌的培养物中不存在SCV一致，均质可用的电子受体的限制，而不是特定的O2限制，是在我们的条件下导致SCV出现和薄膜形成的选择压力。
如前所述，在生物膜中，获得O2通常受到限制，通常局限于生长结构的表面，为了克服这一限制，铜绿假单胞菌可以通过电子载体如吩嗪，有趣的是，在无法产生吩嗪的ΔΔphzC1C2 突变体的常备培养物中生长会导致更高的SCV比例。
对于无法将吩嗪-1-羧酸转化为化脓蓝蛋白的phzM突变体观察到相同的结果，phz突变体突变与外源性补充的化脓青蛋白互补抑制了SCV的出现，表明这些突变体特异性缺乏化脓青素的产生促进了SCV的出现，WT常备培养物中添加的化脓青蛋白浓度增加与SCV的出现呈负相关，支持吩嗪的存在与静置液体培养物中出现的SCV之间的相关性。
为了确定缺乏潜在的有效电子穿梭而不是缺乏化脓青素本身是否是导致SCVs速率较高的原因，我们接下来关注细胞外DNA，它增强了生物膜中的电子穿梭。
有趣的是，DNase的添加使静置培养物中SCV的百分比翻了一番，表明eDNA的减少，可能导致电子穿梭效率降低，促进SCV的出现，这些结果表明，缺乏化脓蓝蛋白可能会损害有效的电子穿梭，以减轻O限制的影响，可用性，导致SCV出现增加。
氧化还原状态被平衡
电子受体的限制使细胞内氧化还原状态不平衡，化脓青素促进氧化还原平衡，特别是在没有电子受体的情况下，由于缺少两者O2或化脓性蓝蛋白促进SCV的出现，我们假设细胞内氧化还原状态可能与SCV的出现直接相关。
事实上，在常设文化中，O2可用性有限，在孵育的前14小时内，NADH/NAD比值比电子受体不限制的15小时标准搅拌培养物高24倍，在补充了KNO的胰蛋白酶大豆汤中进行相同的实验3.正如预期的那样，NADH/NAD比率在指数生长阶段的早期仅略有增加，但迅速恢复到对应于24小时标准搅拌培养物的基础水平。
证实了细胞内氧化还原状态在电子受体的可用性不受限的条件下并非不平衡，与先前的观察结果一致，在O中检测到SCV2-孵育20小时后限制站立培养物，但它们的出现几乎在补充了KNO的静态培养物中被完全废除。
硝酸盐呼吸液保持低NADH/NAD比率的事实表明它不是O+2铜绿假单胞菌检测到的限制本身，并导致SCV的选择，而不是NADH/NAD比率的不平衡，SCV的选择与细胞内氧化态相关，促进SCV出现的条件是细胞内氧化还原的不平衡，由于SCV在站立培养物中20小时后很容易检测到。
因此我们得出结论，铜绿假单胞菌WT感知的NADH/NAD阈值在0.00151±4.7E-4和0.00046之间，±9.8E−5，引人注目的是，在SCV出现时，不平衡的NADH/NAD比率随着时间的推移而降低，最终达到搅拌培养物的低水平。
在非限制性电子受体条件下，具有平衡的比率，这一观察结果表明，铜绿假单胞菌在种群中的SCV选择可能导致细胞内状态的再平衡，并可作为铜绿假单胞菌在O下的适应性策略加以利用2-有限的条件。
在铜绿假单胞菌自然生境中，SCV的出现可能在适应策略中发挥关键作用，研究最多的铜绿假单胞菌栖息地之一是CF感染的宿主，铜绿假单胞菌是CF患者的主要病原体，感染后，铜绿假单胞菌定植CF粘液，CF粘液是一种显示O2带O的渐变2-将环境限制为厌氧环境，铜绿假单胞菌可以在缺氧/厌氧CF粘液中生长。
厌氧生长可以部分地由末端电子受体硝酸盐支持，允许反硝化产生能量，有趣的是，CF样本已经多次报道了SCV，也可能是对缺氧的氧化还原应激反应的一部分，主要负责生物膜的形成，生物膜是CF气道中铜绿假单胞菌的主要表型，我们推测缺氧/厌氧环境的压力诱导铜绿假单胞菌获得表型特征，例如切换到SCV表型。
使其能够增强生物膜形成并逃避宿主防御和抗菌治疗，确保其存活，在动物模型中建立了铜绿假单胞菌SCV的出现与感染持久性之间的相关性，支持SCV表型在慢性感染条件下具有适应性优势的观点。
由于铜绿假单胞菌是CF个体发病率和死亡率的主要原因，并且由于对许多抗生素，更好地了解有助于铜绿假单胞菌在感染期间的存活和毒力的途径，在O 2-饥饿的环境，是制定对抗铜绿假单胞菌感染的策略的核心。
结论
研究结果表明，在还原环境下，一些与细胞骨架和黏附相关的基因表达水平发生了变化，这些基因的调控可能与细菌形成小菌落的适应性有关，进一步的研究发现，小菌落变异对铜绿假单胞菌的代谢产生了影响，使其能够更好地利用环境中的资源。
参考文献：
布莱姆·达卡尔，《微生物概况：铜绿假单胞菌》
昂德·戈雷莫尔，《铜绿假单胞菌在大型建筑物的前提管道中》
佩格里尔·格里尔斯克，《铜绿假单胞菌：发病机制和宿主防御的新见解》