RNA提取是分子生物学研究中至关重要的步骤之一，而Trizol法因其高效的裂解细胞和可靠的RNA保护性而被广泛应用。在本期内容中，小编给大家整理了Trizol法提取RNA的原理、实验步骤、注意事项等，助您轻松掌握Trizol法提取RNA的实验精髓。
简介
Trizol是一款创新型的总RNA提取试剂，其成分包括变性剂，如异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇。这些变性物质迅速破坏细胞结构，并同时抑制核酸酶的释放。异硫氰酸胍是解偶剂之一，具有高效的蛋白质变性作用，可以溶解蛋白质、消除蛋白质的二级结构，从而导致细胞结构的降解，进而实现核蛋白与核酸的快速分离。β-巯基乙醇主要起到破坏RNase蛋白质中的二硫键的作用。
在细胞裂解之后，蛋白质、DNA、RNA等物质被释放。这些物质根据它们在不同pH值和极性溶剂中的溶解度差异进行分离。
（图片来源于网络）
基本原理和特点
基本原理：
Trizol法：即异硫氰酸胍-苯酚法。
强变性剂异硫氰酸胍首先使细胞裂解，并使核蛋白复合体中的蛋白变性。
在特定pH条件下，由于DNA和RNA的溶解度不同而被分离，DNA位于中间相，RNA位于水相，再有机溶剂来沉淀RNA即可得到纯度较高的RNA。
特点：
研究基因表达和调控时，通常需要从组织和细胞中提取和纯化RNA。
TRIzolRNA提取方法具有以下优点：操作迅速，能够抽提多种总RNA，对少量和大量组织细胞均能有效分离，适用于不同分子量大小的RNA，避免了DNA和蛋白质的污染，提取的RNA适用于多种实验。
实验材料
细胞样品、TRIzol试剂、氯 仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC、H2O、离心管、离心机、EP管、匀浆器、移液管、冰袋、漩涡振荡器。
实验步骤
1、样品处理： （1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2） 组织： 取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
2、加入0.2ml氯 仿，振荡15s，静置2min。3、 4℃离心，12000g×15min，取上清。4、加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5、4℃离心，12000g×10min，弃上清。6、加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7、晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
RNA 质量检测
1、分光光度计测定：包括Nanodrop 2000和Agilent 2100，是通过检测RNA在260nm处的最大吸收峰来进行的。通过测量样品的OD260和OD280，可以估计RNA的含量和纯度。一个OD260为1的溶液含有40ug/ml的RNA。
对于纯的RNA，其OD260/OD280比值应为2.0。如果比值偏小，可能表明有机溶剂或蛋白质污染比较严重。如果比值偏大，则可能表示RNA已经发生降解。
然而，单独依靠吸光度值来估计RNA含量和纯度并不十分可靠。为了更全面地判断，需要结合其他方法进行综合分析。
2、凝胶电泳法：制备1.2%琼脂糖凝胶，然后将样品混合RNA加载缓冲液后注入电泳槽的上样孔。电泳液使用新鲜的1×TAE缓冲液。RNA loading buffer 配方：
（图片来源于网络）
在紫外光下拍照时，观察到三条明显的带，从上到下分别是28s RNA、18s RNA和5s RNA。其中，28s RNA（5kp）的亮度应为18s RNA的两倍，且没有涂抹状条带，这样的RNA质量是合格的。
吸光度测定法无法区分DNA和RNA，而电泳法如果在上样孔内观察到亮亮的带，通常表示有DNA污染。如果DNA会干扰后续实验，可以使用DNase进行消化去除。
通过与标记物（marker）比较，可以估计RNA的含量。标记物通常会提供关于其上样量和最亮带对应的DNA量的信息。例如，DNA标记物最亮的带对应1ug，如果RNA带的亮度与标记物相比，可以大致估算RNA的量。
（图片来源于网络）
注意事项
（1）在整个实验过程中，要特别注意预防RNA酶的污染。这包括佩戴口罩、更换新手套、提高实验速度以减少潜在的RNA酶接触时间，使用RNase清除剂对实验环境进行无酶处理，以及选择无酶处理的EP管和枪头。
（2）实验所需的试剂，如TRIzol、PBS溶液、乙醇溶液、氯仿、异丙醇等，在实验前应提前在4℃冷却，确保试剂的稳定性和可靠性。
（3）注意，实验所使用的一些试剂，如氯仿等可能对人体有不利影响，因此在操作时应采取必要的防护措施。
（4）为了保证实验的准确性，所使用的试剂应该进行单独分装，使用专用的瓶子，切勿与其他实验混合使用，以防交叉污染。
（5）为了减少在吸取上清液时移液器操作可能的失误，可以在1000/1250μl枪头上叠加一个10μl的枪头，降低液体吸液速度，提高提取的精确性。
（6）在离心操作时，固定EP管的放置方式能够有效提高吸取液体的手感，确保操作的稳定性。
其他
RNA的定量计算：
1、RNA的定量方法与DNA定量类似。RNA在波长260nm处具有最大的吸收峰。因此，可以使用260nm波长进行光度计测定RNA浓度，其中1的OD值相当于约40μg/ml的单链RNA。当使用1cm的光程 时，通过将DNA样品用ddH2O稀释n倍并以ddH2O作为空白对照，根据测得的OD260值，可以计算出样品在稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数（n）/1000
2、RNA纯品的OD260/OD280比值为2.0，因此可以通过OD260/OD280比值来估计RNA的纯度。如果比值较低，表明存在残余蛋白质；而如果比值太高，则提示RNA可能发生了降解。
RNA完整性的鉴定：
1、首先，使用紫外分光光度计对RNA样本进行浓度测量。RNA样本的OD260/OD280比值应在1.8到2.2之间，而OD260/OD230比值应在2以上，这表明样本的质量良好。通常认为，OD260/OD280值在1.8-2.2之间表示纯度较好，小于1.8可能存在蛋白质残留，而大于2.2则可能暗示RNA的降解。OD260/OD230比值在2以上则表示样本无污染，而小于2.0可能存在盐离子污染。
2、随后，配置无酶化的电泳缓冲液，并制备1% EB琼脂凝胶。对电泳槽等设备进行无酶化处理，以确保实验环境的无酶状态。
3、将RNA样本加入1% EB琼脂糖凝胶槽中，以90-110V的电压进行恒压电泳。
4、在凝胶成像仪下进行成像，观察是否出现三条清晰的RNA电泳条带，分别对应28s、18s和5s。若28s条带的亮度大致为18s条带的两倍，说明RNA的完整性较好，没有明显的降解。
RNA的保存方法：
在进行RNA提取或样品重复使用时，可能会带入少量的RNase污染。为了减少RNase污染以及由此引起的样品降解，正确的保存方式至关重要。可选择使用含有0.1mmol/L EDTA的DEPC水或市售的RNA储存液来溶解RNA，并将其存储于-80℃。常见的缓冲液有助于RNA在-80℃下稳定保存，可长达1年。
当需要取出保存的RNA时，务必注意在冰上进行解冻操作。如果样本较多，应根据需要分装，以防止反复冻融对RNA造成的损害，并防止RNA受到RNase的污染。这些措施有助于确保保存的RNA质量和完整性。