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肺癌对人类健康构成巨大威胁。最近，铁死亡疗法被认为是一种很有前途的肺癌治疗策略，它能促进细胞内活性物质（ROS）产生和脂质过氧化（LPO）积累。然而，细胞内ROS水平不足以及药物在肺癌病灶中积累不尽人意，阻碍了铁蛋白疗法的疗效。近日，来自暨南大学的黄莹、黄郑炜教授团队进行了可吸入生物矿化脂质体用于环状Ca2+爆发中心内质网应激增强肺癌铁死亡治疗的相关研究 。研究成果以“Inhalable Biomineralized Liposomes for Cyclic Ca2+-Burst-Centered Endoplasmic Reticulum Stress Enhanced Lung Cancer Ferroptosis Therapy”为题于2023年03月08日发表在《ACS Nano》上。
图1 相关机制及流程图
本文构建了一种可吸入生物矿化脂质体LDM，与二氢青蒿素（DHA）和pH值反应性磷酸钙（CaP）共同装载，作为铁蛋白纳米诱导剂，实现以Ca2+爆发为中心的内质网（ER）压力增强肺癌铁蛋白疗法。 具备优良的雾化性能，肺部病灶药物积累量比静脉注射高6.8倍，使所提出的可吸入LDM成为肺癌治疗的理想纳米平台。由DHA介导的具有过氧化桥结构的芬顿样反应可以促进细胞内ROS产生并诱导铁死亡。在DHA介导的肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）抑制协助下，CaP外壳降解引起初始Ca2+爆发引发Ca2+介导的强烈ER压力，随后诱发线粒体功能障碍，进一步促进ROS积累，从而加强了铁死亡。第二次Ca2+爆发是由于Ca2+通过细胞膜上铁素体孔流入而发生，从而依次构建了"Ca2+爆发-ER压力-铁素体"循环。以Ca2+突发为中心的ER应激增强型铁死亡过程是一个由明显细胞内ROS和LPO积累驱动的细胞肿胀和细胞膜破坏过程。所提出的LDM在正位肺肿瘤小鼠模型中表现出肺部保留特性和非凡抗肿瘤能力。 总之，所构建的铁蛋白纳米诱导剂可以成为一种潜在定制纳米平台，用于基于雾化肺部给药，强调以Ca2+爆发为中心的ER应激增强肺癌铁蛋白疗法的应用。
图2 LDM的制备和表征，LD和LDM的粒径分布
LDM通过薄膜分散-超声法合成，在核心上人为冠以CaP层。经过生物矿化后，脂质体的流体力学直径（DH）从98.5毫米增加到了100毫米。 多分散指数（PDI）没有明显变化，表明47纳米左右的矿化壳的形成。LDM也表现出单分散的特性和核壳结构，证明了CaP在脂质体上的外涂层。 生物矿化后的脂质体的zeta电位为-17.9 ± 0.3 mV。与装载DHA的脂质体（LD）相比，在空白的生物矿化脂质体（LM）和LDM的X射线光电子光谱（XPS）中发现了347 eV和350 eV的Ca2+峰。表明CaP已经在外壳中进行了生物矿化。此外，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）也显示DHA在1708 cm-1左右特征CO峰，在LD组中存在，而在LDM组中没有，说明DHA封装和CaP的外壳覆盖。以上结果证明了核壳结构LDM的成功制备，在7天内具有良好的稳定性。不同的pH值下，对LDM的pH反应性降解过程进行了监测。结果显示LDM显示出明显的pH值依赖性降解曲线。在酸性环境中，LDM结构分解，其中LDM粒径明显增大，是由于LDM致密的CaP层松动导致。 总之由于具有被动靶向能力，反应灵敏的CaP壳有望赋予LDM肿瘤选择能力。CaP外层具有良好的pH值反应特性，可以暴露出脂质体核心，促进药物释放。
图3 LDM在肺部给药的可行性和体内分布，雾化前后LDM的颗粒大小和PDI
与口服等传统给药途径相比，肺部给药在肺部病变处具有良好的蓄积能力，具有更高的治疗效果。 因此，本文对LDM在肺部给药的可行性进行了系统的评估，以确保LDM在肺部的准确传递。LDM悬浮液通过连接到自行设计的给药装置的超声波雾化器进行雾化。 雾化后，颗粒大小和PDI的变化可以忽略不计，表明雾化过程中LDM的结构完整性得到了保持。接着还探讨了通过自行设计的雾化装置雾化脂质体的分布均匀性。结果显示八个独立通道的荧光强度没有显示出明显的差异，表明有理想的雾化均匀性。因此，雾化方法对于LDM的体内肺部输送是可行的。只有当载体中的有效载荷精确地传递到目标组织时，才能发挥有效的治疗作用。在使用A549-luc细胞的正位肺肿瘤小鼠模型中，对雾化后的脂质体的生物分布进行了追踪。显示腔内注射的DID-LM主要表现在肝脏（占77.75%），很少到达肺部（3.89%），主要因为有被网状内皮系统逮捕的趋势。雾化后，肺部蓄积量明显增加，比静脉注射组高约6.80倍，显示出药物在肺部病变中的蓄积量较高。 此外，雾化脂质体与癌细胞的共定位分析显示，雾化脂质体与癌细胞的信号呈平行分布，重叠度高，这说明生物矿化脂质体可以很好地沉积在肺癌细胞中。总之，LDM具有极好的雾化性能和在肺部病变中的高累积性，可以作为治疗肺癌的理想纳米平台候选者。
图4 环状Ca2+爆发的诱导和Ca2+分布的重新规划，循环性Ca2+爆发过程的示意图
环状Ca2+爆发是由最初CaP降解和SERCA抑制诱发的，可以通过强烈的ER应激来加强铁素体，最终破坏细胞膜。然后，随之而来的Ca2+涌入细胞膜上的铁素体孔，可能有助于第二次Ca2+爆发。为了证明这一点，对细胞内的Ca2+水平和分布进行了评估。首先，用Fluo-4 AM探针测量细胞内的Ca2+水平。用LD和LDM培养细胞的Ca2+荧光强度以时间依赖方式增加，后者在培养12小时后显示出最高的荧光强度，与FCM的结果一致。这些趋势在24小时培养后仍保持不变。 LDM组最高的细胞内Ca2+水平可能归因于循环Ca2+爆发，是由CaP降解和铁质孔的形成的协同效应诱发的。 下一步是确认铁素体孔的形成，这不仅是铁素体诱导磷脂双分子层破坏的结果，也是第二次Ca2+爆发的触发因素。首先用DIO探针对细胞膜进行染色。在对照组和LM组，绿色荧光呈连续分布，表明细胞膜是完整的。LD组的一小部分细胞膜分布为不连续的小点，代表细胞膜在一定程度上的解体。LDM组的细胞膜完全损坏，没有完整的细胞膜。与对照组相比，LDM诱导细胞肿胀，细胞高度增加，表面粗糙度增加，这是由于细胞内Ca2+爆发过程导致的细胞内渗透压增加。 此外，在单细胞的三维表面形貌图像中，可以清楚地观察和记录到铁素体孔。综上所述，所有这些结果共同表明了铁素体孔的形成。
图5 带瘤肺部切片的病理分析，不同处理后的带瘤肺部的H&E染色
接着进行体内抗肿瘤效果实验。利用A549-luc细胞构建正交肺癌小鼠模型，对LDM雾化后肿瘤抑制效果进行了深入探究。采用生物发光成像技术来监测A549-luc肺癌细胞的生长情况。结果显示对照组中肺部肿瘤的强烈信号验证了A549-luc细胞的侵入性和增殖性表现。 LD雾化对肺癌的生长显示出有限的抑制作用，而LDM雾化则明显抑制肿瘤的生长。LDM治疗表现出最强的肿瘤抑制率和最慢的肿瘤生长曲线，显示出最高的肿瘤抑制效率。 此外，LDM组在第14天显示出最低的肺部体外生物发光强度，与体内的结果一致。通过ICP-MS测定主要器官中的Ca2+水平。LDM组肺部的Ca2+浓度最高，进一步证明Ca2+爆发参与了抗肿瘤过程。此外，其他主要器官（心脏、肝脏、脾脏和肾脏）Ca2+水平没有差异，进一步表明雾化的LDM主要在肺部积累。 总的来说，基于铁诱导作用和以Ca2+突变为核心的ER应激联合治疗，雾化LDM后非凡的抗肿瘤能力和Ca2+水平的肺部保留率表明其可以作为一种高效的癌症治疗方法得到潜在的应用。
总之，本文成功制造了一种可吸入生物矿化脂质体，与DHA和CaP共载，作为一种高效的铁蛋白纳米诱导剂，实现铁蛋白和Ca2+爆发为中心的ER应激协调合作，用于肺癌治疗。LDM可以通过肺部给药在肺部病变处实现高肺部积累，证明其作为一种有前景的肺部给药载体的潜在可能性。释放的DHA通过产生大量的-OH诱导铁死亡。同时，由CaP降解和SERCA抑制引起初始Ca2+爆发造成的强烈ER应激反应，进一步导致Ca2+分布的重新规划和线粒体的功能障碍，通过ROS产生有效加强了铁死亡过程。第二次Ca2+爆发是由细胞外基质中Ca2+通过细胞膜上铁蛋白孔加速涌入肿瘤细胞而发生的，最终导致细胞死亡，成功实现以Ca2+爆发为中心的肺癌铁蛋白疗法。雾化处理的LDM对肺腺癌显示出强大而全面的抗肿瘤活性，肺部的Ca2+蓄积增加。此外，LDM对气管的局部毒性和全身毒性可以忽略不计。综上所述，本研究构建了一个具有高效力和安全性的脂质体载体，它有可能成为基于雾化肺部输送的定制纳米平台。此外，通过以Ca2+爆发为中心的ER应激开发铁蛋白纳米诱导剂用于肺癌治疗。将启动进一步的临床前研究，以加速该系统的临床转化。
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