【专家论坛】药物性肝损伤新型生物标志物的研究进展
邵 珍，邓中平*
（上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海201203）
[摘要]药物性肝损伤(drug induced liver injury，DILI)作为新药研发关注的重点，是药物临床前安全性评价和临床研究的难点，也是国内外肝病研究的热点。传统的肝损伤指标因灵敏性和特异性等因素，限制了其在DILI早期评价中的应用。因此，寻找及验证新的DILI生物标志物已成为近年来新药研究及临床诊断关注的焦点。本文从血清酶学、细胞因子、基因组学、蛋白质组学、代谢组学等方面，对当前具有代表性的新型DILI生物标志物进行综述，以期为DILI的预测和诊断，以及药物安全性评价提供参考。
[关键词]药物性肝损伤；新型生物标志物；肝*毒脏**性；综述
[中图分类号] R595.3
[文献标志码]A
[文章编号]1671-2838 (2017 )05-0321-05
DOI:10 .5428/pcar20170501
药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是由药物和（或）其代谢产物在治疗疾病过程中或治疗后所引发的肝脏不同程度的损害。据报道，每年每10万人中有约19例新发的DILI[1]。随着药物种类的增加，DILI的发病率逐年上升[2]因此，寻找DILI的诊断标志物，尤其是早期诊断指标具有重要意义，筛选与验证新的高灵敏度和高特异性的肝*毒脏**性生物标志物已成为国内外研究的热点。
目前，预测和诊断DILI的标志物仍以传统肝功能指标为主，如血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素(TBiL)等。然而这些指标在DILI特异性诊断上存在局限性，如血清ALT水平上升可能是肝外组织损伤，如骨骼肌损伤所引起。有报道称大鼠体内80%的AST均为线粒体AST，提示只有在较严重的肝坏死情况下，血清AST才会显著升高[3]。可见，传统生物标志物的检测并不能完全满足临床前评价以及临床诊断的灵敏性以及特异性的要求，因而寻找理想的新型肝损伤生物标志物迫在眉睫。本文从血清酶学、细胞因子、基因组学、蛋白质组学和代谢组学等方面综述了目前研究较多的、具有潜在应用价值的新型肝损伤生物标志物，以期为DILI的预测和诊断，以及药物临床前安全性评价提供参考。
1 血清酶学生物标志物
近年来，广泛研究谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GLDH)作为新型肝损伤标志物。GLDH在肝组织中的活性最高[4]，是肝线粒体特异性酶。McGill等[5,6]发现，在对乙酰氨基酚引起的肝损伤病人中，血清GLDH、ALT和线粒体DNA都显著升高，认为GLDH既可以作为肝损伤的指标，也是线粒体损伤的标志物。在肝细胞发生损伤时，GLDH快速释放进入血液，有时在ALT未发生明显变化时，血清GLDH就会显著性升高。Harrill等[7]在研究肝素对肝脏的作用时发现，受试者在临床未出现任何肝损伤迹象时，血清GLDH已升高了16倍。因此，作为潜在的肝损伤标志物，GLDH具有较高的灵敏度、组织特异性以及稳定性。
苹果酸脱氢酶( malate dehydrogenase，MDH)、对氧磷酶1（paraoxonase-l，PON1）、嘌呤核苷磷酸酶(purine nucleoside phosphorlyase，PNP)等也是受到关注的潜在的肝毒性标志物。Schomaker等[8]首次评估GLDH、MDH、PON1及PNP等作为肝毒性标志物的应用价值，该研究表明，GLDH以及MDH具有临床诊断肝损伤特异性，而PON1以及PNP则与肝损伤无明显相关性。而Ferré等[9]通过CCI4诱导肝纤维化来研究PON1的活性与脂质过氧化、肝损伤的相关性，发现PON1的活性在肝损伤早期就受到了明显抑制，并随着肝损伤的加重而降低。对于PNP，也有学者认为在对乙酰氨基酚致小鼠肝损伤模型中，PNP和MDH的升高要早于ALT[10]。MDH、PON1、PNP能否成为潜在的DILI生物标志物，尚待进一步验证。
2细胞因子生物标志物
肝毒*药性**物可诱使机体发生炎症或炎症级联反应，从而影响血液中细胞因子水平。因此，细胞因子可能成为潜在的肝*毒脏**性生物标志物。在DILI发生时，部分细胞因子通过促进炎症、参与先天和适应性免疫反应，加重DILI，且不同细胞因子变化可反映肝损伤程度。Steuerwald等[11]通过比较急性肝损伤病人与健康人的27种细胞因子表达情况，认为先天免疫相关细胞因子的高表达提示治疗效果较差，而适应性细胞因子的高表达则表明预后良好。
细胞角蛋白18 (cytokeratin 18，CK18)是肝细胞骨架的重要组成成分，主要分布在细胞浆内，在维持肝细胞结构和功能的完整中起着重要的作用，是肝细胞损伤诱导表达的应激蛋白。美国FDA将其视为DILI的标志物之一。有报道称，CK18缺乏或者突变会增加转基因小鼠肝细胞的脆性[12]。另外，角蛋白翻译后会发生磷酸化，这种修饰作用与肝病进展密切相关[13]，其中Ser33和Ser52位点发生磷酸化是很多慢性肝损伤的共同表现。常远等[14]通过研究发现，随着肝损伤程度的加重，在Ser33和Ser52位点磷酸化的CK18表达量也明显升高，可以作为肝细胞损伤或凋亡的信号分子[15]。
穿透素(pentraxin)是一类多功能蛋白，其中穿透素-3（pentraxin-3，PTX-3）在炎症反应中有重要的作用，能够识别病原体，参与细胞反应。研究发现，持续升高的PTX-3可作为指示肝脏疾病的一个新的有前途的标志物[16]。Craig等[17]在研究中发现，在过量对乙酰氨基酚引起的肝损伤中，需要肝移植或最终死亡的病人血浆中的PTX-3含量高于幸存者。Yaman等[18]也发现过量对乙酰氨基酚引起的大鼠肝损伤模型中，细胞中PTX-3的水平显著升高。
Yang等[19]对高迁移率族蛋白（high mobility group box-l，HMGB1）在对乙酰氨基酚诱发的小鼠肝坏死中的作用机制进行研究，发现HMGB1的活性状态可能可以推断药物对肝脏的损伤情况，从而推断损伤的进程。在对小鼠胆汁瘀积型肝损伤研究中发现，对小鼠进行胆管结扎手术后，HMGB1及全链细胞CK18出现明显上升，变化较传统指标ALT更为明显，且变化结果与组织病理学结果一致[20]。
3基因组学生物标志物
人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)基因的多态性与DILI之间存在一定的相关性，与肝脏的特异性免疫有关[21,22]。Phillips等[23]在南非进行的一项随机、双盲试验中发现，HLA-B* 5801和HLA-DRBl*0102基因与奈韦拉平引起的DILI有关。石艳会等[24]发现HLA-DRB1(rs9269186)基因型与肝细胞癌的发生相关。目前，HLA基因与DILI的相关性研究主要集中在单体型上。但药物敏感性可能不仅局限于一个或几个HLA单体型多态性，而是涉及更为复杂的免疫反应和机制，需要多个HLA单体型多态*交性**互作用[25,26]因此，HLA基因与DILI的相关性研究对于发现潜在的DILI基因生物标志物具有参考价值，但作为常规的检测项目应用于临床尚具有一定的局限性。
microRNA作为肝*毒脏**性的潜在生物标志物具有较高的灵敏度和肝脏特异性，具有良好的应用开发前景，该方面的研究也已取得较大进展。Wang等[27]总结了当前所研究的microRNA的生物来源，并分析了其作为临床诊断的肝毒性标志物的价值及可能性，指出目前最具潜力的为miR-122、miR-192、miR-193及miR-155。王雁等[28]从灵敏性、特异性和稳定性三个方面系统地评价了miR-122，认为它有潜力成为DILI标志物，且较传统指标血清转氨酶来说更加灵敏。Wolenski等[29]在醋氨酚或CCl4引起大鼠肝毒性的实验中发现，血浆中有17种microRNA升高，其中miR-122、miR-802、miR-31a和miR-365在肝脏中的含量最丰富，且miR-802与miR-122的升高相似，于是认为这4种microRNA是潜在的肝损伤血浆生物标志物。
4蛋白质组学生物标志物
血红素加氧酶1（hemeoxygenase-l，HO-1）是血红素分解的限速酶，参与了胆红素的代谢调控[30]。在机体处于氧化应激损伤时，它能作为一种保护蛋白被诱导。马磊等[31]发现，在利福平致小鼠肝氧化应激损伤模型中，肝组织中的HO-1表达显著升高，提示HO-1可能是利福平肝毒性发病机制中的重要分子。Gao等[32]分别给予大鼠低、高两个剂量的醋氨酚，并在给药后6和24 h对肝组织进行16O/18O标记和2D-LC /MS分析，发现给药后大鼠血浆中的HO-1急剧增加，认为HO-1可作为肝损伤潜在的血浆标志物。
5代谢组学生物标志物
代谢组学通过比较药物作用前后代谢表达谱的变化，能较全面地反映生物体的生理和代谢状态，从而筛选出与肝损伤相关的特征性代谢物，有效地评价药物的肝*毒脏**性，在DILI新型生物标志物的应用中也取得了突破性进展，成为发现生物标志物的重要途径。Trottier等[33]在临床上对两类胆汁瘀积型肝脏疾病（原发性胆汁性肝硬化和原发性肝硬化胆管炎）的研究中，发现两类病人胆汁酸的水平及构成与对照组相比发生了明显的改变。Luo等[34]的研究发现毒物引起肝损伤时，胆酸、甘胆酸及牛磺胆酸、ALT、AST、GLDH均有所升高；胆管增生型肝损伤时则仅有结合型胆酸（甘胆酸和牛磺胆酸）升高，推测胆酸的变化与肝脏损伤的类型有相关性，认为单种胆酸水平可以用于区分啮齿类动物的肝脏损伤类型。总胆汁酸的变化在中药源性肝损伤中的应用也逐渐受到关注。本课题组早期通过对山豆根给药大鼠的代谢组学的研究表明，给药组大鼠的胆汁酸分布与空白对照组相比有显著性差异，这与Yamazaki等[35]报道的胆汁酸平衡的破坏可能是DILI早期症状表现之一的结论相一致。
视晶酸(ophthalmic acid，OA)是一种内源性的三肽类聚合物，参与谷胱甘肽的代谢。Kaur等[36]在对乙酰氨基酚所致肝衰竭的病人的回顾性分析中，发现最后死亡病人在研究阶段的前后期，其血清中可频繁地检测到视晶酸。Geenen等[37]测定了美沙吡林所致肝损伤大鼠体内OA的含量，发现其浓度与AST呈负相关。因而，推测OA也可作为药物引起肝损伤的生物标志物。
6展望
我国近10年的病例分析发现，引起DILI的前3类药物分别是中药( 25. 08%)、抗结核药(21. 43%)和抗微生物药(13.17%)[38]。可以通过观察药物在不同时间、不同种属动物给药后的变化，发现药物潜在肝毒性，作为临床前的安全性评价重要依据。然而，因为代谢、种属等差异，尚无法完全准确地判断药物对人体是否存在肝损伤风险。
DILI作为药物最严重的不良反应之一，已引起药物研发者以及临床医务人员的高度关注。目前，已有的miRNA-122、HMGB-1、CK18等标志物，虽然较“金指标”ALT及国际标准比值(INR)的准确度及灵敏性更高[39]，但还处于实验研究阶段，且DILI发生、发展机制复杂，这类具有潜在临床价值的分子是否具有普遍意义，或仅适用于某种特定的药物肝*毒脏**性等方面有待考证，需进一步研究。
虽然DILI生物标志物的研究在很多方面还存在局限性和亟待解决的问题，但随着生命科学与医学研究步人大数据时代，系统生物学、网络药理学、生物信息学等多学科快速发展，对标志物的筛选已从“单一分子”向“组合分子群”研究模式转变。整合多种组学技术所产出的海量数据，高效的网络分析平台的建立，为高通量筛选新型高特异性、高灵敏性DILI生物标志物提供了强大技术支撑，为防治DILI的新药研发、临床诊断及个体化治疗提供理论依据，有利于阐明药物与DILI的关联性，也为DILI的精准治疗及新药研发提供可能的靶标，并将推动新药筛选、药物安全性评价、临床肝脏损伤疾病预防及诊断等方面的发展。
【参考文献】略