来 源：石洪洋，董 慧，刘 嘉，崔笑天，郭 毅，洪 兰．人参皂苷Rg1对心肌细胞氧化应激损伤的抑制作用 [J]. 中草药, 2023, 54(24): 8117-8126.

人参为五加科植物人参 Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎，具有提高免疫力[1]、改善心血管功能[2]、缓解疲劳和抗氧化[3]等多种功效。人参皂苷Rg1是人参主要活性成分之一，具有显著的抗氧化、抗肿瘤等作用[4-6]。氧化应激是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发生心室重构的关键因素，最终导致线粒体功能损伤和细胞凋亡[7]。但人参皂苷Rg1对H2O2诱导心肌细胞的氧化应激是否起保护作用尚不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～25个核苷酸组成的非编码RNA，具有调节基因表达等功能。研究发现，人参皂苷通过调节miRNA的表达发挥抗氧化应激的作用，miR-499是一类与抑制氧化应激损伤有关的RNA[8]，已被证明在心血管疾病的发病和进展中发挥作用[9]，包括心肌肥大[10]、缺血性心脏病[11]等。

miR-499已被确定为AMI和心力衰竭的潜在生物标志物[12-13]。miR-499c是和miR-499同源的一种特殊RNA，由德克萨斯A&M大学发现，可以将多种干细胞诱导转化为心肌细胞[14]，但miR-499c是否具有对心肌细胞的保护作用尚不清楚，并且其是否参与人参皂苷Rg1的抗氧化机制更不甚清楚。故本研究旨在探究人参皂苷Rg1对心肌细胞氧化应激损伤的抑制作用，并通过体外构建H9c2细胞的miR-499c转染模型，探讨人参皂苷Rg1通过miR-499c参与氧化应激的抑制作用，以评估其在心脑血管疾病治疗中的潜在价值。

1 H9c2氧化应激模型制备

如图1所示，75～1200 μmol/L的H2O2处理H9c2细胞20 min，细胞存活率降低，并呈剂量相关性。600 μmol/L的H2O2处理细胞20 min后，细胞存活率显著降低至（60.39±2.87）%（ P ＜0.001）。因此，选用600 μmol/L的H2O2作为制备氧化应激模型条件。

2 人参皂苷Rg1对H9c2细胞氧化应激损伤的抑制作用

2.1 人参皂苷Rg1对氧化应激模型细胞存活率的影响

如图2-A所示，不同浓度的人参皂苷Rg1处理H9c2细胞24 h后，细胞存活率无明显影响，表明人参皂苷Rg1对H9c2细胞无毒性作用。如图2-B所示，与对照组比较，模型组细胞存活率明显降低（ P ＜0.001）；与模型组比较，人参皂苷Rg1（40、80 μmol/L）组细胞存活率显著升高（ P ＜0.01、0.001），且呈剂量相关性。本团队前期研究工作中发现ANP可以抑制H9c2细胞氧应激化损伤且具有心肌保护作用，因此利用ANP作为阳性对照发现，ANP对氧化应激模型H9c2细胞存活率作用与40 μmol/L人参皂苷Rg1的作用相近[16]。

2.2 人参皂苷Rg1对H2O2诱导的H9c2细胞LDH漏出率的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组细胞LDH漏出率显著升高（ P ＜0.001）；与模型组比较，各给药组LDH漏出率均明显降低（ P ＜0.01、0.001），且呈剂量相关性。

2.3 人参皂苷Rg1对H2O2诱导的H9c2细胞MDA水平和SOD活性的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组细胞MDA水平显著升高（ P ＜0.001），SOD活性显著降低（ P ＜0.001）；与模型组比较，各给药组MDA水平显著降低（ P ＜0.01、0.001），人参皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）组SOD活性显著升高（ P ＜0.01、0.001），且呈剂量相关性。

2.4 人参皂苷Rg1对H2O2诱导的H9c2细胞ROS水平的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组细胞ROS水平显著升高（ P ＜0.001）；与模型组比较，人参皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）组和ANP组ROS水平显著降低（ P ＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性。

2.5 人参皂苷Rg1对H2O2诱导的H9c2细胞线粒体膜电位的影响

氧化应激可以引起细胞线粒体膜电位的改变，导致线粒体损伤，进而引起细胞凋亡及坏死。如图6所示，与对照组比较，模型组细胞绿/红色荧光比值升高（ P ＜0.001），表明H9c2细胞线粒体膜电位降低；与模型组比较，各给药组绿/红色荧光比值显著降低（ P ＜0.05、0.01、0.001），表明人参皂苷Rg1和ANP均可以使H2O2引起的H9c2细胞线粒体膜电位恢复。

3 人参皂苷Rg1对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

如图7所示，与对照组比较，模型组cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Bax蛋白表达水平均显著升高（ P ＜0.001），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（ P ＜0.001）；与模型组比较，各给药组cleaved Caspase-9和Bax蛋白表达水平均显著降低（ P ＜0.01、0.001），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（ P ＜0.05、0.01、0.001）；人参皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）组cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著降低（ P ＜0.01、0.001）。提示人参皂苷Rg1可以减少H2O2诱导的H9c2细胞凋亡。

4 人参皂苷Rg1对H9c2细胞miR-499c表达的影响

为探讨人参皂苷Rg1对H9c2细胞抗氧化的作用机制，首先观察人参皂苷Rg1对H9c2细胞内 miR-499c 表达的影响。如图8所示，与对照组比较，人参皂苷Rg1组 miR-499c 表达显著升高（ P ＜0.05）。

5 miR-499c在人参皂苷Rg1抑制H2O2诱导H9c2细胞氧化应激损伤中的作用

5.1 miR-499c在人参皂苷Rg1抑制H2O2诱导H9c2细胞氧化应激时对ROS生成的影响

如图9所示，与模型组比较，人参皂苷Rg1＋H2O2组、miR-499c＋H2O2组细胞中ROS荧光强度显著降低（ P ＜0.05、0.01），表明miR-499c和人参皂苷Rg1均可以抑制ROS的生成。人参皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2组ROS荧光强度进一步降低，提示miR-499c可能参与人参皂苷Rg1抑制细胞氧化应激损伤。

5.2 miR-499c在人参皂苷Rg1抑制H2O2诱导H9c2细胞MMP降低的影响

如图10所示，与模型组比较，人参皂苷Rg1＋H2O2组、miR-499c＋H2O2组绿/红色荧光比值显著降低（ P ＜0.05、0.01），表明人参皂苷Rg1和miR-499c均可以使H2O2引起的H9c2细胞线粒体膜电位恢复；人参皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2组绿/红色荧光比值进一步降低，提示miR-499c可能参与人参皂苷Rg1抑制细胞氧化应激损伤。

讨论

在心血管疾病中，氧化应激是AMI的重要促发因素之一。一些抗氧化剂药物已被证实可以预防和治疗AMI[17]，但尚未达到满意的效果。人参皂苷Rg1是人参中的重要生物活性成分，在体内外具有抗衰老、神经保护[18]等多种生物活性。本研究重点探讨了人参皂苷Rg1对H9c2细胞的抗氧化作用及其机制。采用H2O2诱导心肌细胞氧化应激模型是最常见的氧化应激模型制备方法，本研究发现，600 μmol/L的H2O2诱导H9c2细胞20 min，能达到最佳氧化应激模型，与先前的研究结果一致[19]。

正常状态下，机体内氧化与抗氧化处于一种动态平衡，但在患病或衰老等状态时会出现因自由基水平升高而导致的病理现象[20]。人体内有抗氧化防御系统，包括内源性抗氧化剂SOD。总SOD活性可以反映机体对氧化应激的抗氧化能力，研究表明，氧化应激会引起SOD的活性增加，但当氧化应激过度时，SOD活性会下降[21]。当细胞受到氧化应激时，引起细胞膜损伤的氧化应激反应，MDA迅速积累[22]。本研究发现，人参皂苷Rg1增加了H2O2诱导的H9c2细胞中SOD活性，同时减少MDA水平。表明人参皂苷Rg1作为外源性抗氧化剂，通过增加内源性抗氧化剂的活性起到抗氧化作用。

ROS是机体内最常见的自由基[23]，ROS产生过量时能引起线粒体功能障碍，表现为线粒体的形态变化和功能丧失。线粒体膜电位的破坏是线粒体功能障碍的主要标志。线粒体膜电位的丢失导致线粒体电子传递链缺陷、代谢耗氧量减少，从而抑制细胞脂质、蛋白质等的正常功能[24]。结果显示，H2O2诱导H9c2细胞ROS的生成和线粒体膜电位丢失，而人参皂苷Rg1降低了ROS生成，同时抑制线粒体膜电位丢失，表明人参皂苷Rg1通过抑制自由基的生成和线粒体膜电位的丢失，从而起到抑制氧化应激损伤的作用。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族蛋白的典型代表，它们在细胞凋亡过程中发挥重要的调节作用[25]。当细胞内Bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，促进细胞凋亡。当Bcl-2高表达时，Bcl-2与Bax形成异源二聚体，抑制细胞凋亡[26]。所以细胞内Bax/Bcl-2的比例对决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用。在细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。在线粒体通路中，如Bax被激活后发生寡聚化，并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，释放线粒体内促凋亡因子，如细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）等。

当Cyt C释放到胞内后，形成凋亡复合体，凋亡复合体通过招募并激活Pro-Caspase-9，形成Caspase-9全酶。Caspase-9全酶进一步激活效应Caspase-3和Caspase-7，启动Caspase级联反应，切割细胞中α-tubulin、Actin等超过100种的底物，最终导致细胞凋亡[27]。Caspase家族是细胞凋亡的重要执行者，其主要功能是促进凋亡信号的放大和传递[28]。

在本研究中，人参皂苷Rg1下调Bax和上调Bcl-2表达，呈剂量相关性地降低Bax/Bcl-2的比例，同时人参皂苷Rg1减少cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表达。提示人参皂苷Rg1可能通过抑制Caspases，进而调控Bax与Bcl-2蛋白家族，从而抑制细胞凋亡。

研究发现，miRNA可以调节多种基本细胞功能包括细胞凋亡和坏死，这是AMI中的2个关键细胞事件[29-30]。其中miRNA-499可以保护心肌细胞免受AMI诱导的凋亡作用[31]。其他研究也证实，miR-499通过靶向程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、钙凋磷酸酶和动力蛋白来保护心肌细胞免受缺血/再灌注诱导的细胞凋亡[32]。血浆miR-499被证明通过靶向PDCD4促进内皮炎症，PDCD14抑制下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）信号通路[33]。提示miR-499可能作为治疗AMI血管炎症的潜在靶标[34]。miRNA-499c是在前期工作中发现的一种具有将非心肌细胞诱导为心肌细胞功能的miRNA。

本研究发现预处理人参皂苷Rg1可以增加H9c2细胞miR-499c的表达。同时转染miRNA-499c后再预处理人参皂苷Rg1后发现，与单纯转染miR-499c或单纯预处理人参皂苷Rg1相比，ROS显著降低和线粒体膜电位恢复明显。提示人参皂苷Rg1可能通过miRNA-499c对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激起抑制作用。

综上，人参皂苷Rg1通过抑制H2O2诱导的H9c2细胞ROS的生成，从而减少线粒体膜电位的丢失和线粒体氧化应激，最终抑制细胞氧化应激和细胞凋亡，此作用可能与miRNA-499c有关。本研究为人参有效成分开发新的心脑血管疾病药物提供参考。