首先咱们来做个小测试，假设您现在的身体处于一种感冒状态，你会做出那种选择？
A:多喝水，多运动
B:去药店买点感冒药吃
C:去医院挂号就诊，按照处方拿药
如果感冒不是特别严重，相信大多数人都会在A和B之间选择，除了自己扛，就是去药店买点感冒药，而很多时候为了感冒早点好，会不由自主选择抗生素类药。抗生素早已是家喻户晓，人尽皆知了。从1929年弗莱明发现青霉素，到1942年青霉素的大规模商用以来，抗生素类药物的出现帮助人类或动物攻克了很多疾病问题，比如肺结核、炭疽病、鸡球虫病等，不得不说抗生素是大家健康的守护者。近日，南京农业大学的高修歌老师课题组通过转录组测序结合百迈客云平台分析等方法研究了一种抗生素（马杜霉素）诱导心肌损伤的分子机制。文章发表在《Archives of Toxicology》上，影响因子5.9以上。文章题目： Transcriptome profile analysis reveals cardiotoxicity of maduramicin in primary chicken myocardial cells.
研究背景
马杜霉素是从真菌Actinomadura rubra中分离出的有效离子载体抗生素，主要用于控制鸡肉中的鸡球虫病。但是由于其安全范围相对较窄，在农场动物和人类中已经报道了许多马杜霉素中毒的事件。在大多数的报道中指出，马杜霉素和其他离子载体损伤的靶器官主要是心脏和骨骼肌。但是，迄今为止，马杜霉素诱导的心*毒脏**性的机制在鸡和其他动物中仍不清楚。该研究探索了马杜霉素诱导心肌损伤的分子机制，对马杜霉素在原代鸡心肌细胞中的毒性有更系统的了解，这将有助于进一步探索马杜霉素的毒理机制，以及为马杜霉素解毒研究做了较好的铺垫。
材料和方法
取13-14日龄无特定病原体（SPF）鸡胚胎的心室分离原代鸡心肌细胞，用5μg/ mL马杜霉素处理24小时后收集鸡心肌细胞，使用0.1％二甲基*砜亚**（DMSO）处理的细胞作为对照。对照组和实验组分别进行三个样品重复，共6个样。
测序平台：百迈客Illumina HiSeq 4000平台
分析平台：百迈客云平台（BMKCloud）
研究结果
1.马杜霉素对鸡心肌细胞活力的影响
该研究首先通过不同浓度的马杜霉素和不同处理时间进行CCK-8测定和分析，选用5μg/ mL计量马杜霉素处理24小时的鸡心肌细胞用于RNA-Seq研究。
2.RNA-Seq数据和差异表达基因（DEGs）的鉴定
本研究对马杜霉素处理组（M_1,2,3）和对照组（C_1,2,3）的6个样本，进行转录组测序。质控后每个样品得到约49.7M高质量的clean reads，Q30均在85%以上，且 61.49–72.59%能比对到参考基因组上（表1）。共有1442个转录本差异表达，其中810个基因上调，632个基因下调。
表1.实验组和对照组RNA-Seq测序数据
3.差异表达基因的GO和KEGG分析
对差异表达基因进行GO分析，收集前20个显著富集的GO terms（图1）。在细胞组成的类别中，主要条目有“胞液” “细胞质”“细胞质的核周区”和“核仁”。 在生物过程类别中，主要条目是“高尔基体逆行运输”，“药物反应”和“细胞压力反应”。差异表达基因分子功能类别中主要与“ATP结合”，“蛋白质结合”和“转录共激活剂活性”有关。
图1. 马杜霉素处理细胞中DEGs富集最丰富的GO terms
为了鉴定马杜霉素处理的鸡心肌细胞中所有差异表达基因的功能，使用KEGG数据库对差异表达基因的路径进行注释。结果显示共126个通路， 图2展示了前50条通路，其中最显著富集的途径是类固醇生物合成（ko00100）、细胞因子—细胞因子受体相互作用（ko04060）、MAPK信号通路（ko04010）、toll—like受体信号通路 （ko04020）、GnRH信号通路(ko04912)、细胞凋亡(ko04210)以及一些有趣的items，包括钙离子信号通路(ko04020)、p53信号通路（ko04115）、细胞周期（ko04110）、PPAR信号通路（ko03320）、吞噬体（ko04145）和内吞作用（ko04144）。
图2. 马杜霉素处理的心肌细胞中DEGs的KEGG分析
4.RT-qPCR实验验证差异表达基因
为了验证RNA-Seq数据的可靠性，随机选取19个基因进行RT-qPCR实验。结果显示所选的19个基因的表达水平与差异表达基因分析结果一致，表明RNA-Seq分析的准确度高。
5.鸡心肌细胞毒性相关的关键差异表达基因
在由RNA-Seq分析鉴定的所有DEG中，细胞因子—细胞因子受体相互作用，细胞凋亡，钙信号和细胞质空泡化是与马杜霉素诱导的细胞毒性密切相关的关键代谢途径。根据GO和KEGG的分析结果，细胞因子—细胞因子受体相互作用是马杜霉素处理过程中变化最大的路径。 在这些与细胞因子—细胞因子受体相互作用有关的差异表达基因中几种典型的促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-8属于上调的差异表达基因中。
细胞凋亡是KEGG分析中的重要途径。 该研究中，细胞凋亡相关差异表达基因中，编码属于半胱天冬酶家族的凋亡执行蛋白的CASP3被上调表达，而属于Bcl-2家族的BOK和BAG2下调。 更重要的是，大多数p53信号相关基因上调。结果表明，这些基因的调节对介导马杜霉素的细胞毒性是至关重要的。
研究结果显示，通过马杜霉素处理后，显著上调的基因有KCNA2、CHAC1、CACFD1、KCNJ4、KCNK1、SLC24A4和SLC4A4，而显著下调的基因有KCNK2、SLC6A4、ABCA8、KCNG3、CNN2、CAPN5、KCNJ8和KCNQ3，说明马杜霉素能改变鸡心肌细胞的细胞内离子。 另一方面，参与液泡形成途径的差异表达基因显著富集。 这些液泡形成相关基因提示马杜霉素处理期间可能有空泡形成。
6.马杜霉素增强炎症反应
ELISA法测定TNF-α、IL-8、IL-18、IFN-γ等促炎性细胞因子的浓度，以验证炎症反应相关的差异表达基因的功能。 结果显示，马杜霉素处理的细胞中TNF-α和IL-8的浓度均显著高于对照组（P <0.05）。 但是，马杜霉素对IL-18和IFN-γ的浓度没有影响（图3）。 TNF-α和IL-8水平升高表明促炎性细胞因子的增加可能是马杜霉素中毒引起。
图3. 不同浓度的马杜霉素处理鸡心肌细胞24小时，鸡心肌细胞上清中TNF-α，IL-8，IL-18和
7.马杜霉素诱导的细胞凋亡
如图4a，b所示，马杜霉素处理后，细胞凋亡率呈剂量依赖性升高。 Western blot结果显示，马杜霉素处理24小时后裂解半胱天冬酶-3的表达增加（图4c，d），表明马杜霉素激活了凋亡途径。 这些结果与RNA-Seq分析中的上调凋亡基因一致，明确了马杜霉素诱导的鸡心肌细胞凋亡的剂量。
图4. 马杜霉素诱导的鸡心肌细胞凋亡
8.马杜霉素干扰细胞内钙稳态
为了进一步证实马杜霉素对钙信号的影响，在马杜霉素处理24小时后进行流式细胞术和比色法分析。 结果显示Fluo 3的荧光增强，表明细胞内钙水平与对照相比显著升高（图5a，b）。 此外，马杜霉素处理后，Ca 2+ -ATPase活性呈剂量依赖性增加，而Na + -K + -ATPase活性并没有呈剂量依赖性增加（图5c，d）。 总之，这些数据表明马杜霉素干扰了细胞内钙离子稳态。
图5. 马杜霉素干扰鸡心肌细胞的离子平衡
9.马杜霉素导致细胞质中大量空泡
除了RNA-Seq和生物信息学分析方法，研究人员还进行了马杜霉素诱导中毒的空泡相关研究。结果显示，马杜霉素诱导不同大小的phase-lucent细胞质空泡的大量积累。
结论
该研究采用RNA-Seq技术和基因表达谱分析显示毒性剂量的马杜霉素显著改变原代鸡心肌细胞的转录模式。共鉴定了1442个差异表达基因， 810个基因上调， 632个基因下调，通过GO和KEGG通路富集分析确定了马杜霉素诱导的心*毒脏**性的关键路径。它与细胞因子—细胞因子受体相互作用，细胞凋亡，钙信号和细胞质空泡化相关。进一步通过实验验证了RNA-Seq结果并揭示了马杜霉素的毒性机制。马杜霉素处理后(0.05, 0.5 and 5 µg/mL)，炎症细胞因子TNF-α、IL-8、细胞凋亡率、caspase-3活性、细胞内钙离子浓度、Ca 2+ -ATP酶活性均升高。这些结果表明，如果要减轻或治疗马杜霉素诱导的心肌损伤，应在治疗过程中考虑炎症控制，细胞离子稳定，细胞凋亡减少以及细胞膜稳定。另外，通过形态学和透射电镜观察，在细胞质中发现大量的液泡形成。这是首次对马杜霉素诱导原代鸡心肌细胞转录组学研究，揭示了马杜霉素通过多种分子机制在原代鸡心肌细胞中表现出了毒性。对马杜霉素诱导心脏中毒机制的的认识提供了更全面的理论依据。
参考文献
Gao X G , Peng L , Ruan X C ,et al,(2017). Transcriptome profile analysis reveals cardiotoxicity of maduramicin in primary chicken myocardial cells. Archives of Toxicology :1-15. doi: 10.1007/s00204-017-2113-8.