文：远笙纪
编辑：远笙纪
黄豆酱，又称豆酱、大豆酱，是一种传统调味品，集调味和营养于一体。它具有丰富的营养成分和独特的色香味。黄豆酱的原料主要是面粉和黄豆，通过加入米曲霉等微生物，经过控温发酵制成半流动态食品。
黄豆酱富含膳食纤维、低聚糖、大豆异黄酮、皂苷、多酚等营养成分。然而，在实际生产过程中，黄豆酱仍然存在一些问题。
随着货架期的延长，常常出现一些白点类物质，严重影响产品质量，降低消费者的购买欲望。
早期的研究认为，这些白点可能是由微生物污染、酪氨酸结晶、蛋白质过度水解等原因导致的。
酪氨酸结晶的形成主要是由于发酵过程中酶的作用，使原料物质产生氨基酸、肽等小分子物质，在后续水解反应中，通过酪氨酸羧肽酶的作用形成酪氨酸，并随着反应的进行，酪氨酸过饱和而结晶析出。
而过饱和的状态受环境的pH、温度以及高温蒸煮条件下豆粕蛋白质的变性程度和周围渗透压环境等多种因素的影响。
我们主要以黄豆酱为对象，对市售黄豆酱中的白点物质成分进行分析，并在明确其主要成分的基础上，通过优化工艺减少白点的形成，提高黄豆酱的品质。
黄豆酱白点不是由微生物污染引起的
实验所用的菌种为米曲霉沪酿，所用的试剂有草酸、乙酸、富马酸、甲酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、酪氨酸、CH4O。
所用的仪器有GCMS-QP2010Ultra气相色谱-质谱联用仪、LC-20A型高效液相色谱仪、KDN-08B定氮仪、MultiskanGo酶标仪、自动电位滴定仪。
随后，我们取一定量白点物质，制成悬浮液后分别涂布在细菌和真菌培养基上，同时在没有经处理的白点物质上也进行涂布。细菌和真菌培养温度分别为30℃和37℃，培养3天后观察菌落形成情况。
我们取一定量白点样品于烧杯中，加入少量5%三氯乙酸使其溶解，然后转移至25mL容量瓶中，用0.4mol/L LTC(A)定容。静置使白点充分溶解后使用双层滤纸过滤，得到待测样品，对氨基酸进行测定。
从带有白点物质的黄豆酱中挑取出白点物质，制备成悬浮液后分别在营养肉汤培养基和YPD培养基上培养3天。
结果显示，挑取的白点物质经过细菌和真菌培养基培养后都没有形成任何菌落，说明黄豆酱白点不是由微生物污染引起的。
氨基酸组成分析
将含有天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸等17种氨基酸的混合标准溶液注射进样器，样品量为20μL，得到氨基酸混合标准品的液相色谱图谱，详见图1。
图1
接上
根据高效液相色谱图的分析结果显示，白点的主要成分是酪氨酸，占总氨基酸含量的87.25%，其他氨基酸占4.44%。有8.31%的成分未能与标准品的出峰时间匹配，推测为杂质。
分析原因是由于白点经常出现在黄豆皮、辣椒籽等表面，所以在挑取白点时很难避免这些杂质的进入。
基于以上测定结果，鉴于酪氨酸在白点中占较大比例，将酪氨酸作为后续研究的重点对象。
针对有白点和无白点的黄豆酱，分别进行了3次平行实验，并进行了TCA-NSI（三氯乙酸-氮溶指数）、DH（蛋白水解度）以及酪氨酸含量的显著性分析，结果如表1所示。
有无白点黄豆酱在TCA-NSI、DH和酪氨酸含量方面的显著性水平P值均小于0.05，表明在这些指标上两种豆酱存在显著差异。可以认为黄豆酱白点的形成与TCA-NSI和蛋白质水解度有一定关联，而DH和TCA-NSI都代表了蛋白水解的程度。
酪氨酸的生成和蛋白水解程度密切相关，而酪氨酸结晶会促使白点形成。因此，研究蛋白水解程度为控制白点产生提供了参考依据。
图2
最近的研究聚焦于羧肽酶在黄豆酱生产过程中的性质。黄豆酱白点中的内肽酶和外肽酶共同作用下，酪氨酸得以产生。
其中，外肽酶的作用尤为重要，它能够将酪氨酸从酪氨酸末端切割下来，形成游离的酪氨酸。这种外肽酶包括酪氨酸羧肽酶，具有广泛的作用位点，能够水解疏水性氨基酸。
因此，研究酪氨酸羧肽酶的酶学性质，对于优化黄豆酱的发酵工艺，降低酪氨酸的生成是非常重要的。
为了探究温度对酪氨酸羧肽酶酶活的影响，研究者选择了Z-Gly-Tyr二肽作为底物，并进行了实验。实验结果如图3和图4所示。
图3
从图3中可以观察到，当水浴温度在25~40℃范围内时，酪氨酸羧肽酶酶活呈正相关趋势，随着温度的增加，酶活逐渐提高，达到40℃时达到最高点。
然而，在40℃以上的温度范围内，酶活开始下降，与温度呈负相关。这可能是因为高温会影响酶的空间结构，导致酪氨酸羧肽酶的酶活性下降。
因此，为了有效控制酶活性，黄豆酱的发酵温度应保持在25~35℃或40~45℃的范围内。
图4
通过对该羧肽酶进行热稳定性实验，根据图4的结果可知，将酶在25~45℃的水浴中孵育约2小时后，酶活仍能保持在超过70%的相对活性水平，表明该酶在这一温度范围内具有较好的热稳定性。
然而，在50℃水浴中孵育0.5小时后，相对酶活性开始下降。因此，温度实验为选择合适的发酵温度提供了依据。
原料配比对白点产生的影响
选择适合的原料配比是提高黄豆酱品质的重要措施之一，因为原料是黄豆酱生产的基础。在微生物酶的作用下，蛋白质原料和淀粉质原料经过复杂的代谢过程形成黄豆酱特殊的风味。
而酪氨酸羧肽酶作为蛋白酶家族的一员，主要影响酪氨酸的形成。不同的原料配比提供的碳源和氮源会影响微生物酶的代谢，从而对酪氨酸羧肽酶的酶活性产生影响。
通过比较黄豆与面粉按照5:5、6:4和7:3不同配比所得的大曲酪氨酸羧肽酶活力，可以看出整体趋势是先上升后下降的。
其中，在36小时时，酶活力达到最高点分别为335.46 U/g、329.51 U/g和264.99 U/g。三种配比中，以7:3配比的酶活性最低。
图5
在黄豆酱的酿造过程中，大豆中的蛋白质经微生物和各种酶的作用分解为可溶性含氮化合物，例如氨基酸和多肽。面粉则被分解成各种糖类，包括单糖、双糖和多糖。
在适宜的温度下，氨基酸和糖类物质会发生美拉德反应，生成棕褐色物质。因此，实验跟踪测定了黄豆酱的pH值、总酸含量和氨基酸态氮等理化指标。
总酸是一个重要的指标，因为在发酵过程中，一些碳水化合物被米曲霉分解产生有机酸，微生物细胞自溶后会积累游离脂肪酸，并且还会生成各种氨基酸，导致各种酸类物质不断积累，从而使总酸含量升高。
如果总酸含量过高，可能是因为存在耐温产酸的微生物存在于酱醪中，导致总酸大量积累。
过多的酸类物质会对黄豆酱的口感产生不良影响，因此在实际生产中应尽量避免这种情况的发生。因此，实验测定了三种原料配比下黄豆酱的总酸含量。
通过比较图6中的三种原料配比，其中黄豆与面粉按照7:3的配比下，黄豆酱的总酸含量最高，为1.72 g/100g，而其他两种配比下的总酸含量分别为1.49 g/100g和1.53 g/100g。三种配比下的总酸含量均满足黄豆酱国家标准中总酸含量≤2.0 g/100g的要求。
上为图6 下为图7
根据图7的结果，可以观察到随着发酵的进行，黄豆酱的pH值呈下降趋势，前期下降速度较快，后期基本保持稳定。
这种pH变化的原因与总酸类似。在三种原料配比下，发酵终端的pH值分别降低到4.88、4.95和4.80，均位于正常发酵范围内。
氨基酸态氮含量是一个重要的指标，用于评价黄豆酱的质量，国家标准中也要求对其进行测定。
氨基酸态氮主要指以氨基酸形式存在的氮元素含量。氨基酸的生成丰富了黄豆酱的风味，例如天冬氨酸和谷氨酸构成了黄豆酱的鲜味，此外还含有其他的甜味、酸味和苦味氨基酸。
黄豆酱在发酵过程中，pH值呈下降趋势，而氨基酸态氮含量是评价其质量的重要指标之一。这些指标的变化与发酵过程中的酸度和氨基酸产生有关。
图８ 不同配比下发酵期间氨基酸态氮含量的变化
根据图8的结果显示，大豆含量越高，氨基酸态氮含量也越高。在整个发酵过程中，黄豆酱使用不同比例的原料配比，氨基酸态氮含量均呈上升趋势。
其中，配比为7：3的氨基酸态氮含量最高。然而，在黄豆酱发酵10天后，氨基酸态氮的上升速度缓慢下来。这是因为部分氨基酸态氮与还原糖发生了羰氨反应，导致一部分氨基酸态氮被消耗掉。
尽管发生了消耗，由于生成量大于消耗量，氨基酸态氮仍然保持上升的趋势。
最终，不同原料配比的黄豆酱在发酵终端的氨基酸态氮含量分别为0.67、0.78和0.81g/100g，满足了黄豆酱国家标准中对氨基酸态氮含量≥0.5g/100g的要求。
结论
根据微生物检测结果，白点现象不是由微生物污染引起的。通过高效液相色谱分析，发现白点物质中含有17种氨基酸，其中酪氨酸占87.25%。
因此可以判断白点物质的主要成分是酪氨酸。对黄豆酱白点性质的研究结果显示，有白点的黄豆酱蛋白质水解程度明显高于无白点的黄豆酱，并且酪氨酸含量较高。
这两者之间存在显著的相关性，我们可以推测白点的形成与蛋白质过度水解有一定的关系。
羧肽酶酶学性质的研究结果表明，在温度为30～35℃和40～45℃时，酶活性较低，而相对酶活性在3小时内仍能保持在70%以上。
当黄豆与面粉按7:3配比时，酶活性最低。在该配比下，发酵终端的总酸含量为1.72g/100g，符合黄豆酱国家标准中总酸含量≤2.0g/100g的要求。
pH值在黄豆酱正常发酵范围内维持在4.8。氨基酸态氮含量为0.81g/100g，满足黄豆酱国家标准中氨基酸态氮含量≥0.5g/100g的要求，并且在3种配比下含量最高，发酵终端的酱醪中未发现白点类物质生成。