前言
聚乙xi亚胺 (PEI) 是一种水溶性阳离子高分子聚合物, 每相隔两个碳原子,即每第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何 pH 下都能充当有效的质子海绵体, 早在1995年被用于体外核酸转染。
带正电荷的PEI利用静电交互作用缩聚带负电的核酸并形成易被细胞摄取的正电小粒径复合体, 这种凝聚核酸的能力影响转染效率。目前市面上有多种不同类型的PEI转染试剂,但基本只在PEI的某些特殊的结构、分子量等方面稍有不同,其基本原理基本一致,即借助PEI所含的大量胺基具有质子海绵效应, 促使PEI-核酸复合物逃离出内涵体和溶酶体继而在胞内释放核酸使目的基因得以表达。
Polysciences PEI
Polysciences PEI转染试剂因其较高的转染效果,已被应用于AAV、LV和重组蛋白等工业化生产,成为多数科学工作者、生物技术公司的主流方式。Polysciences 成立于1961年,公司提供一系列PEI产品,研究级产品 PEI MAX 和 Transporter 5,及 cGMP 级 MAXgene GMP,提供适合于各规模 AAV、LV 病毒载体和重组蛋白的制造。
转染后生产的病毒滴度/蛋白产量是工业生产中重Yao一环,但对于来源于不同客户、不同的项目来说,转染后的产量往往参差不齐,这正是由于在转染中会有多种条件会干扰转染过程,从而影响产量。也正由于转染过程中多种条件都可能对结果产生或多或少的影响,因此需在不同的项目中进行条件优化。小编将给大家介绍一下在细胞转染过程中都有哪些条件可能影响实验结果。
1、培养基配方:无血清,不影响转染,能够支持高密度细胞生长
细胞培养基是盐、碳水化合物、维生素、氨基酸、代谢前体、微量元素等形成的的复杂混合物。在进行细胞培养时,通常还需要加入一些添加物,例如血清、抗生素等,有时还需要根据培养需要加入一些特殊的生长因子。但对于不同细胞系/种类来说,培养他们时所需要的营养成分各不相同,因此选择适合某一类/一种细胞的细胞培养基不容忽视。
目前市面上有多种不同类型的培养基,包括用于常规贴壁培养的培养基和适用于无血清悬浮培养的培养基,例如OpiM-M无血清培养基、Freestyle293表达培养基、RPMI-1640、MEM、DMEM 高糖/低糖等。但有些培养基虽然能够增加细胞活力,但却对转染及生产存在不利影响(图1)。因此需筛选合适的培养基。此外,对于使用Polysciences转染试剂的客户来说,小编建议您在进行转染操作时,推荐使用如下表所示的培养基种类(见下表1)。
另外,血清是一种包含生长因子及其他辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有显著差别。血清质量的变化直接影响细胞生长,因此,选择适合的血清种类也不容忽视。由于血清中不确定成分/蛋白因子的存在,在转染过程中可能会影响转染效率,因此小编建议您在转染前使用无血清或低血清(2%-5%)细胞培养基进行细胞培养。但是,如果选用培养基作为质粒DNA与PEI孵育时的稀释液,在整个转染复合体形成的过程中须严格限制血清的使用(应使用无血清培养基作为稀释液),因为有些血清中的一些蛋白因子会阻碍质粒DNA与PEI的结合,导致转染效率的下降。此外,对新加培养基进行预热对细胞转染有很多帮助。
Fig.1 测试了五种不同培养基类型的细胞生长和AAV病毒产生。各培养基类型下细胞均呈指数增长,其中培养基类型A的细胞生长和AAV产量不错。
2、培养空间:摇瓶中培养基总体积不超过培养瓶总体积的20%(总体积 < 500 ml)或30%(总体积 > 500 ml)
对于使用悬浮细胞进行蛋白/病毒生产来说,在进行生产前在小体积模型中进行条件摸索及优化的一个重Yao环节。不少用户会选择在125/250/500 ml摇瓶中进行条件探索,一方面经济节约,另一方面能够快速得到大致的结论,但是在此过程中培养的总体积对产量的影响容易被忽略,往往会认为更大的培养体积有利于提升产量,然而当培养总体积过大时往往会导致后期培养瓶中营养匮乏,氧气浓度不足以支撑细胞正常生长,造成细胞受损等,导致实验屡屡受挫,结果难达预期。
那么该如何选择合适的培养体积以达到更大的生产效果呢?小编建议当使用总容量小于500ml的摇瓶时,细胞培养总体积不超过培养瓶总体积的20%,其中在15%-20%为宜;当培养瓶总容量大于500ml时,细胞培养总体积不超过培养瓶总体积的30%,其中维持在25%-30%为宜。
3、细胞:选用处于对数生长期,活力高,代次低(30代以内)的细胞进行转染
细胞质量是影响转染效果的因素之一。(传代)细胞状态良好,处于对数生长期的细胞转染效果更佳(对于每个细胞来说,倍增时间越短,转染效率越高)。因此,使用质量较高的细胞系是保证生产指标的因素。
细胞在经过长时间(数年)传代之后往往会经历突变、染色体重组或基因调控改变等,这可能会导致细胞的行为发生改变,影响原有的细胞功能,即在一株细胞系经过百次至千次传代后,与相同细胞系低代次的细胞相比其生物学性状可能会发生不同程度的改变,其中一些改变可能导致与转染相关的细胞行为受到影响。一般来说,低细胞代数能确保基因型不变。
适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,此时细胞生长旺盛,更容易转染(图2)。同时,小编建议在进行抗体/病毒生产时,所转染细胞的传代数不应超过30代。因此,如果发现转染效率降低,可以试着转染新复苏的细胞以恢复更佳结果。
另外,如果选择贴壁细胞来执行生产任务,那么细胞汇合度是影响转染的因素之一。细胞需要一定的汇合水平才能发挥更佳作用。事实上,这是因为细胞间所发生的相互作用,换句话说,细胞之间的直接接触和细胞通讯,以及细胞和细胞之间通过分泌因子进行的细胞交流,是保证细胞生长和分裂的基本需求,也是保证细胞良性生长的因素。
总之,细胞的各项指标,包括倍增时间、传代次数和细胞汇合水平等可能改变细胞的生物学行为,从而对转染产生一定程度的影响。在转染时应选用处于对数生长期,活力高,代次低(30代以内)的细胞进行转染。
Fig.2 使用相同参数转染低、中、高传代细胞,以确定细胞培养代次是否影响转染效率和 rAAV 生产。
4、细胞密度:推荐在1~3×106cells/ml进行优化, 也可尝试高细胞密度,比如4/5×106cells/ml
在悬浮培养条件下,培养基中细胞密度与细胞本身的状态息息相关。在细胞密度较低的情况下,细胞有更多的空间和养分供应,因此可以更快地生长和繁殖。但当细胞密度过低时往往由于细胞与细胞之间相互作用降低导致细胞分化,影响细胞功能,降低转染效果及产毒能力。
在细胞密度过高时,细胞之间又会发生竞争,养分和空间变得有限,导致细胞代谢降低、生长速率减缓。此外,乳酸是细胞代谢的副产物,乳酸对细胞具有毒性作用,高密度培养情况下会导致培养基中乳酸不断积累,影响细胞状态,降低细胞活力,影响转染效率及抗体/病毒产量。
因此,细胞密度应该适当控制,以保证细胞的生长速率和细胞数量的平衡。小编建议在进行转染前将细胞密度控制在2 × 106cells/ml左右为宜,用户也可根据自身需要对细胞密度进行优化,推荐优化范围为1~3 × 106cells/ml;如需更高细胞转染密度(比如4/5 × 106cells/ml),客户可根据需求进一步对相关参数进行调整,小编建议高细胞密度转染时适当降低质粒用量。
5、质粒及用量:1~2μg/1×106细胞,高细胞密度时(如 5×106cells/ml)需要酌情考虑降低DNA用量,比如0.4μg/1×106细胞
在进行转染操作时,需关注高质量的质粒(高纯度、无菌、无内毒素)DNA。由于转染基于正负电荷相互吸引的原理,如果DNA不纯,如带少量的蛋白质、盐离子、细胞代谢物等会影响转染复合物的有效形成,进而影响转染效率。
一般通过检测质粒的吸光度(OD值)来判断质粒的质量。OD值A260 / A280值大于或等于1.8,意味着该质粒DNA是纯的;A260 / A280小于1.8,表明样品可能存在酚类(苯fen)或蛋白质污染;读数大于2.0,则表明样品被RNA污染。小编建议对于转染所用质粒其OD值应位于1.8~1.95之间。
除此之外,在质粒DNA抽提时,内毒素需清除干净。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,很稳定,需要很长时间高温或强化试剂才能清除干净,对宿主是有毒性的。内毒素清除的效果决定能否有效转染,当内毒素水平过高时,即使选用高浓度质粒DNA也无法获得理想的转染效果。
质粒用量:在正常情况下(低细胞密度),为了增加转染效率,实验人员在转染时或许更倾向于添加过量的质粒DNA,但是要注意的是,在转染过程中质粒DNA用量过少的确会影响转染效果,导致产量下降,但是质粒DNA量过多同样会降低转染效率。所以在进行规模放大之前,对质粒DNA用量应进行系列优化探索,以期达到理想的转染效果。对此小编建议在转染时,质粒用量首先推荐1μg / 1 × 106cells,用户后续可根据自身情况对质粒用量进行优化,推荐优化范围为1~2μg / 1 × 106cells。当使用高细胞密度(如5 × 106cells/ml)进行生产时,质粒用量应随之改变,一般在高密度下质粒用量推荐在0.4~0.6μg/ 1 × 106cells。
总结
除以上因素之外,转染中还会有多种其它因素,如质粒比例、PEI用量、收集时间等因素影响生产产量,因此在进行蛋白/病毒生产时应按需对多种条件进行优化,以达到更优的生产结果。
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