文 | 云霄钰
编辑 |云霄钰
背景
热应激是影响全球家禽业的最有害的环境压力源之一，因为家禽对热应激高度敏感，其散热的能力是低。热应激降低了蛋鸡的蛋重和蛋壳质量。此外，蛋鸡暴露于高温下会导致蛋鸡血浆钙磷水平的降低，这是影响蛋鸡产蛋和蛋壳质量的重要矿物质。
Te肾在维持钙磷稳态中发挥重要作用，钙磷稳态通过胃肠道吸收和肾脏排泄来平衡。因此，慢性高温下的母鸡血浆钙磷水平较低压力可能与肾功能不全有关。然而，仍然缺乏证据表明热应激对蛋鸡肾脏损害的影响。
肾脏需要大量的能量，因为肾小球重新吸收超滤液来维持稳态；因此，线粒体在肾小管细胞中富集。线粒体是参与与自由基产生能量和信号转导相关的各种过程的关键细胞器。线粒体功能障碍导致氧化应激增加、ATP消耗和细胞死亡，这些都与各种健康问题相关，如癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、神经退行性变和衰老。
最近的研究表明，线粒体损伤在人类和小鼠肾脏疾病的发生发展中起致病作用，表明线粒体稳态和生物发生对维持正常肾功能至关重要。
线粒体DNA是一种不含内含子的非核双链环状DNA。Te线粒体DNA拷贝数被认为是线粒体功能的生物标志物，其改变反映了线粒体生物发生和功能。在环境应激条件下，线粒体中的活性氧水平升高，这可能导致mtDNA-CN的显著降低。事实上，在长期热应激条件下，肉鸡肝脏中组织ATP水平和mtDNA-CN显著降低。由于肾脏是一个含有大量线粒体的高能器官，我们推测热应激会导致母鸡在产蛋期间出现严重的肾线粒体损伤。
在急慢性肾病的病理状态下，mtDNA应激可能有助于环鸟苷单磷酸腺苷合酶通路激活和I型IFN反应。
刺痛是胞质dna定向信号通路的关键适配器，其活性与多种炎症相关疾病相关。mtDNA从受损线粒体泄漏到细胞质中是刺刺信号通路激活的关键触发因素。在蛋鸡中，mtDNA-cGAS-STING通路在肾脏炎症和/或虚弱中的作用尚未阐明。
因此，本研究的目的是阐明慢性热应激对蛋鸡肾脏损害的影响，特别关注肾衰竭和线粒体功能障碍的参与。
材料和方法：组织学分析和烧伤面积分析
肾组织在4%多聚甲醛中发酵，在70%、80%、90%、95%和100%乙醇中脱水，并用对聚二酚包埋。parafn包埋的组织在4 μm下切片，在一系列二甲苯和乙醇溶液中再水合，然后用于马森三色染色，正常组织区域为红色，核为黑色，融合区域为蓝色。
用光镜观察肾脏组织的组织病理学变化。使用Image J软件6.0版，每个样本随机抽取8只猫进行振动面积定量。在相同的条件下，以相同的放大倍数获得图像。Te模糊面积以捕获图像面积的百分比表示。
总RNA分离、cDNA合成和实时聚合酶链反应（PCR）
按照制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒从肾脏样本中提取总RNA。采用随机引物对1 μg总RNA合成互补DNA。采用QuantStudio 5实时PCR系统和雷鸟SYBR qPCR主混合系统进行实时PCR检测mRNA的表达水平。Te引物序列靶基因和内参基因鸡白细胞介素（IL）-12的PCR引物购自Qiagen。
mtDNA相对表达量和拷贝数的测定
按照制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒从肾脏样本中提取线粒体DNA。所有步骤均在室温下完成，每个样品同时进行一次处理。使用QuantStudio 5实时PCR系统，使用雷鸟SYBR qPCR主Mix检测mtDNA的相对表达。目的基因和内参基因的Te引物序列。
组织ATP含量、使用ATP检测试剂盒提取肾组织中的细胞ATP。简单地说，小块组织洗涤一次，在ATP提取试剂中重悬，1000×g离心10 min。Te上清液用于ATP检测。根据制造商的说明，使用含有荧光素和荧光素酶的ATP检测试剂盒来定量Te ATP水平。
统计分析
所有数据均采用学生t检验进行分析。以蛋鸡为实验单位。数据以平均±SE表示。Te结果在P≤0.05时为显著，在0.05<P≤0.1时呈上升趋势。
结果：慢性热应激对产蛋性能和蛋壳品质的影响
如表4所示，在实验期间，长期热暴露降低了产卵率、蛋重和日产蛋量。热暴露还会降低蛋壳强度、厚度和蛋壳重量。实验结果表明，在本研究中诱导了热应激。此外，与对照组相比，高温暴露时鸟类的血浆钙和磷酸盐浓度降低。
慢性热应激对肾功能及组织学的影响
虽然血浆尿素氮没有不良影响，但慢性热暴露显著增加血浆肌酐水平，降低血浆水平白蛋白，提示肾功能不全。如图1b所示，Masson的三色染色显示，热应激组的肾出血面积明显增加。
通过定量PCR分析，热应激组中I型胶原alpha 1、α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子-β的基因表达水平升高。这些数据表明，热暴露可引起蛋鸡肾功能不全和肾功能衰竭。
慢性热应激对肾脏线粒体功能的影响
如图2a所示，慢性热暴露显著降低了肾组织中的ATP含量。基于线粒体ND4、COX1、ATP6和ND6基因，采用定量PCR分析蛋鸡肾组织中线粒体DNA拷贝数。热应激鸟类中ND4、ATP6和ND6基因的mt/核DNA的Te比值显著降低。
慢性热应激对cGAS刺痛通路基因及相关因素表达的影响
与对照组相比，热应激组中与cGAS-STING通路相关的MDA5、STING、IRF7、MAVS基因以及相应的调控NF-kB基因的表达量显著增加。此外，在热应激母鸡中，促炎症细胞因子和趋化因子的表达水平显著上调，而IL-8的表达有增加的趋势。
相比之下，其他促炎症细胞因子和趋化因子（IFN-β、IFN、IL-1β和CCL2）的表达没有因热暴露而改变。这些结果表明，热暴露刺激了cGASSTING通路和随后的炎症。
讨论
热暴露是一种非特异性的应激源，可影响牲畜的福利，导致死亡。在本研究中，我们重点关注了母鸡在产蛋期间的肾脏损害。蛋鸡慢性热应激增加血浆肌酐，白蛋白水平降低，提示慢性热暴露导致肾功能衰竭。此外，蛋鸡的热应激显著增加了肾皮质纤维化面积和促纤维化基因的表达。
据我们所知，这是第一个证明热应激诱导蛋鸡肾纤维化的报告。研究结果表明，肾功能衰竭和纤维化，至少是在热应激条件下导致产蛋性能和蛋壳质量下降的部分原因。
肾功能衰竭是慢性肾损伤的常见病理特征。最近的一项研究表明，线粒体功能障碍是肾衰竭发生发展的主要问题。此外，研究还提供了线粒体损伤与mtDNA质量失调之间的关系的证据。mtDNA-CN是指细胞中线粒体的丰度，它依赖于能量需求，可以通过mtDNA拷贝数和mtDN*片A**段的质量来测量。
低组织mtDNA-CN与较高水平的氧化应激相关，是氧化应激相关损伤的致病因素。热应激影响线粒体功能，其特征是反应性水平的增加氧的种类和线粒体氧化还原状态的失衡。Zhang等研究表明，慢性热暴露后肉鸡肝脏中mtDNACN和ATP含量降低。
同样，我们的研究结果表明，与对照组相比，慢性热应激母鸡肾脏的mtDNA-CN显著降低。此外，与未暴露的母鸡相比，热应激的母鸡肾脏中的ATP含量也显著较低。慢性热应激会导致蛋鸡肾脏出现严重的线粒体损伤，这可能导致肾功能衰竭和功能障碍的进展。
最近，Maekawa等人的得出结论，线粒体功能障碍和mtDNA-cGAS-STING的激活该通路是哺乳动物肾脏损伤的关键调控因子。环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合成酶（cGAS）最近被鉴定为在自身免疫性疾病中介导I型IFN信号的关键胞质DNA信号。
在应激或细胞损伤的条件下，DNA自身从细胞核或线粒体泄漏到细胞质中，可以切割cGAS，将ATP和GTP转化为第二信使环GAMP，从而介导STING [50]的激活。为了确定热应激鸡肾衰竭的潜在机制，我们采用qRT-PCR方法检测了cGAS-STING通路相关基因的表达。我们发现，在热应激组中，MDA5、STING、IRF7、MAVS和NF-κB基因的表达均有所增加。
此外，促炎症细胞因子（IL-12）和趋化因子（IL-8、CCL4和CCL20）基因的表达均上调。这些结果表明，热应激蛋鸡肾脏中mtDNA-cGAS-STING通路的激活和随后的炎症诱导。这表明，在蛋鸡中，mtDNA是炎症的关键驱动因素，也是参与炎症和肾功能不全发展的细胞机制。
在本研究中，慢性热应激可上调蛋鸡肾脏中促炎症细胞因子和趋化因子的mRNA水平。促炎细胞因子和趋化因子都影响肾脏疾病的发生和进展。在淋巴细胞积累模型中，IL-12通过IFN-γ分泌和新牙形成促进肾损伤。此外，肾脏疾病[55,56]患者的血清和肾脏IL-12水平升高。趋化因子刺激免疫细胞的迁移，增加粘附分子的产生和活性，这有助于磨损和肾脏损伤。
在人类中，IL-8、CCL4和CCL20基因的表达增加参与了肾脏疾病的发病机制。我们的数据显示，在热应激母鸡中，高水平的促炎症细胞因子和趋化因子基因表达，表明这些细胞因子的释放有助于肾衰竭和衰竭的进展。
结论
本研究结果表明，慢性热暴露可引起蛋鸡肾衰竭和线粒体损伤。热应激引起的线粒体损伤激活mtDNA-cGASSTING信号通路和随后的炎症反应，从而导致肾衰竭和肾功能障碍的进展。由于肾线粒体损伤通过激活mtDNA-cGAS-STING通路诱导肾衰竭，线粒体靶向化合物或刺痛通路*制剂抑**可能是治疗蛋鸡热应激后肾衰竭和功能障碍的一种策略。