文|名城雨

编辑|名城雨

卷心菜蚜虫Brevicoryne brassicae是一种臭名昭著的农业害虫，专门研究芸苔科植物，这些植物由硫代葡萄糖苷进行化学保护。通过将硫代葡萄糖苷从其寄主植物中隔离并产生自己的激活酶（黑芥子酶），这种蚜虫采用自我防御系统来对抗与植物平行的敌人。

然而，我们对蚜虫隔离和激活过程中单个硫代葡萄糖苷的代谢命运以及这种防御对蚜虫敌人的生化作用知之甚少。在这里，我们探讨了这些问题，重点是芸苔属B.和掠食性花边，Chrysoperla carnea。

我们发现芸苔属双歧杆菌以不同的速率积累不同的硫代葡萄糖苷，脂肪族硫代葡萄糖苷的吸收速度比吲哚族葡萄糖苷更快。芸苔属黑芸苔酶对不同硫代葡萄糖苷的酶活性与其体内积累速率密切相关。

令人惊讶的是，在模拟捕食之后，有毒异硫氰酸酯产品（ITC）的生产在数量上被毒性较低的产品（如腈和ITC偶联物）所抵消。然而，防御性鸡尾酒显著损害了C. carnea的发育。硫代葡萄糖苷代谢物的组织特异性定量显示，花边结合和动员来降低脂肪族ITC的毒性，但这些策略仅部分有效。

这些结果阐明了硫代葡萄糖苷在被蚜虫食草动物隔离后和进一步达到更高营养水平后的代谢命运，以及对捕食者生存和发展的影响，可能对针对卷心菜蚜虫的综合害虫管理方法具有指导意义。

芸苔目植物，如芸苔科和芸苔科的植物，产生硫代葡萄糖苷和黑芥子酶，作为对抗不适应的食草动物和病原体的有效双组分防御系统。尽管有这些防御措施，含硫代葡萄糖苷的作物的产量仍受到害虫的极大影响。

硫代葡萄糖苷是葡萄糖基化的前毒素，在富含硫的S细胞中组成型和大量积累，而激活的enyzmes，黑芥子酶（β-硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶）存在于称为黑芥子素细胞的富含蛋白质的成细胞中。

这种物理分隔避免了黑芥子酶无意中水解硫代葡萄糖苷可能导致的自我中毒，因此水解激活酶及其硫代葡萄糖苷底物的混合仅在组织损伤时发生，例如，在食草动物的攻击期间。这样产生的葡萄糖不稳定并重新排列以形成一系列下游代谢物，包括异硫氰酸酯（ITC），简单腈（CN），硫氰酸盐和表硫腈。

水解的结果取决于硫代葡萄糖苷侧链、蛋白质调节剂（指定蛋白）的存在以及反应条件以及金属离子和其他辅助因子的存在。在硫代葡萄糖苷水解产物中，化学反应性ITC（含有–N=C=S*能官**团）在植物-食草动物相互作用中起主要作用。其他水解产物，如CNs，被认为比ITCs毒性小，并且可以在间接防御中发挥作用。

硫代葡萄糖苷是氨基酸衍生的葡萄糖基化特化代谢物。硫代葡萄糖苷的基本结构包括三个构建块：β硫代葡萄糖部分、磺化肟部分和结构多样化的侧链，允许将硫代葡萄糖苷表征为三大类，即脂肪族、吲哚和苯炔质硫代葡萄糖苷。

一般来说，硫代葡萄糖苷衍生的ITC的毒性是由与细胞内亲核试剂反应的亲电-N = C = S*能官**团赋予的。然而，侧链结构也会影响毒性。ITC侧链有助于决定水解后的反应性，并且毒性通过例如-N = C = S基团的快速损失而改变。

此外，侧链的亲脂性可以促进ITCs通过细胞脂质双层膜扩散到达细胞内环境。虽然侧链上的吸电子基团可以增加整体亲电性和反应性，但侧链和靶蛋白之间的静电吸引或空间位阻也会促进选择性反应性。因此，除了亲电–N=C=S*能官**团的独特性质外，各种类型的ITC侧链的结构多样性将其效力扩展到更广泛的靶标。

卷心菜蚜虫Brevicoryne brassicae是一种穿刺吸食草动物，因此可以通过最大限度地减少组织损伤来避免硫代葡萄糖苷 - 黑芥子酶防御系统。这种昆虫是全球芸苔科作物植物的害虫，阻碍植物生长并传播至少20种病毒。

这种昆虫平均每年完成15代，造成高达85%的产量损失。已发现芸苔属双歧杆菌从寄主植物中积累硫代葡萄糖苷。然而，不同的硫代葡萄糖苷如何动态积累尚未阐明。除了在其血淋巴中隔离某些摄入的硫代葡萄糖苷外，芸苔芽孢杆菌在其头部和胸肌中产生自己的内源性黑芥子酶（BMY，芸苔双歧杆菌β-硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶）。

内源性BMY选择性作用于昆虫实际螯合的硫代葡萄糖苷的程度尚不清楚。与植物一样，一旦昆虫组织被捕食者破坏，螯合的硫代葡萄糖苷和BMY相遇导致有毒ITC的形成，使芸苔属B. brassicae绰号“行走的芥子油*弹炸**”。然而，尽管芸苔属具有生态重要性，但影响芸苔属硫代葡萄糖苷水解的因素尚不完全清楚。

芸苔属双歧杆菌螯合的硫代葡萄糖苷及其产生的活化产物可能会向食物链上游移动，并对较高的营养水平造成进一步的负面影响。作为一种重要的生物防治生物，普通的绿色花边金丝雀因其处理蚜虫和软毛虫等猎物的能力而受到越来越多的研究关注。

为测定芸苔蚜中各种寄主植物硫代葡萄糖苷的积累情况，本研究在侵染后0 h、1 h、3 h、6 h、9 d、1 d、2 d、3 d和4 d时间点分析了芸苔蚜及其寄主拟南芥Col-6植株的硫代葡萄糖苷含量。

首先，我们通过在拟南芥myb28myb29cyp79b2cyp79b3植株上养殖蚜虫在10天内清除芸苔属葡语的硫代葡萄糖苷含量。然后，我们将40只成年蚜虫转移到每种拟南蚜野生型植物上，总共有56株植物被感染。

在每个时间点，从四个随机选择的植物中收集10个成年蚜虫，将每个植物的蚜虫汇集到1.5mL Eppendorf管中作为一个样品，即每个时间点四个独立的重复，总共有5个时间点。对这些植物的叶子进行采样并收集在6 mL管中，然后将使用的植物丢弃，不再用于以后的时间点。

为了测量重组BMY的硫代葡萄糖苷底物偏好和芸苔属四龄若虫的蛋白质提取物，用提取的拟南芥葡糖苷测定酶活性。通过在柠檬酸缓冲液中匀浆提取以拟南芥myb79myb3cyp50b10cyp4b1植物为食的芸苔芽孢杆菌可溶性蛋白。

如补充材料中所述纯化大肠杆菌细胞中产生的重组BMY蛋白。使用布拉德福德试剂测量蛋白质浓度。将来自2μL柠檬酸缓冲液（100mM，pH 50.4）中每个样品的1μg蛋白质与来自拟南芥野生型植物的10μL粗硫代葡萄糖苷提取物在28°C下反应。

在10分钟、0分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟反应时间点取出含有60 μL反应溶液的等分试样，并加入90 μL纯甲醇中以立即停止反应。同时，将变性芸苔属蛋白质提取物（在100 °C下加热1 h）和空载体转化的大肠杆菌细胞的蛋白质作为对照进行处理，以寻找硫代葡萄糖苷的非酶促和非BMY降解。随后，通过LC-MS/MS测定剩余完整硫代葡萄糖苷的浓度，以计算硫代葡萄糖苷水解的百分比。

收集以拟南芥野生型植物为食的芸苔属的肉食梭菌进行代谢物分析。收集三龄梭菌幼虫（一个幼虫作为10个样本）。用200μL移液管收集C. carnea幼虫的肛门分泌物，来自三个幼虫作为一个样品汇集。

卷心菜蚜虫芸苔蚜将某些硫代葡萄糖苷与其十字花科寄主植物隔离，但尚未研究单个硫代葡萄糖苷的相对积累速率。为了测量这些化合物的吸收，首先通过饲养硫代葡萄糖苷缺乏突变植物产生不含硫代葡萄糖苷的蚜虫成虫，然后转移到拟南芥Col-0野生型植物中。

然后在6天的实验中，在选定的时间点定量蚜虫积累的硫代葡萄糖苷。进一步比较了蚜虫螯合的硫代葡萄糖苷含量与寄主植物含量。总体而言，相对积累速率表明，脂肪族硫代葡萄糖苷的螯合速度比吲哚硫代葡萄糖苷更快：芸苔属芸苔中的脂肪族硫代葡萄糖苷浓度在一天内超过了拟南芥，而吲哚硫代葡萄糖苷至少需要2天才能达到与寄主植物相同的浓度。

有趣的是，具有甲基亚磺酰基（侧链上有MeS = O*能官**团）的8种脂肪族硫代葡萄糖苷具有不同的积累速率;具有最长侧链的硫代葡萄糖苷，8-甲基亚磺酰基硫代葡萄糖苷，积累效率显着更高。

到第4天积累的最高浓度硫代葡萄糖苷分别是8种脂肪族硫代葡萄糖苷4MSOB-GSL，4MSOO-GSL和1MTB-GSL（4-甲硫基丁基硫代葡萄糖苷）。值得注意的是，55MSOB-GSL在拟南芥野生型Col-3植株的总叶面硫代葡萄糖苷池中占主导地位（约3%），在芸苔属植物中也大量积累。

虽然吲哚硫代葡萄糖苷I6M-GSL（吲哚基-1-甲基硫代葡萄糖苷）也在第1天积累，但其浓度远低于其脂肪族对应物。另外两种吲哚硫代葡萄糖苷仍处于非常低的水平。二龄和四龄芸苔属若虫的硫代葡萄糖苷积累也被量化，发现浓度与成虫相似。综上所述，这些结果表明，不同的硫代葡萄糖苷在蚜虫的所有生命阶段以不同的速率积累，侧链的长度决定了脂肪族硫代葡萄糖苷的选择性积累。

参考文献：

1. Abdalsamee MK，Giampà M，Niehaus K，Müller C （2014）快速掺入硫代葡萄糖苷作为食草动物用来防止黑芥子酶激活的策略。昆虫生化分子生物学52：115-123
2. Agerbirk N，Olsen CE （2012）进化中的硫代葡萄糖苷结构。植物化学 77：16-45
3. Andréasson E，Jørgensen LB （2003） 植物黑芥子酶和硫代葡萄糖苷的定位。在：罗密欧JT（编辑）植物化学的最新进展，第37卷。爱思唯尔，阿姆斯特丹，第 79–99 页
4. Beran F， Pauchet Y， Kunert G， Reichelt M， Wielsch N， Vogel H， Reinecke A， Svatoš A， Mewis I， Schmid D， Ramasamy S， Ulrichs C， Hansson BS， Gershenzon J， Heckel DG （2014） Phyllotreta striolata 跳蚤甲虫使用宿主植物防御化合物来创建自己的硫代葡萄糖苷 - 黑芥子酶系统。美国国家科学院院刊 111（20）：7349–7354
5. 布拉热维奇一世， 蒙托 S， 布尔丘尔 F， 奥尔森 CE， 布罗 M， 罗林 P， 阿格伯克 N （2020） 植物中硫代葡萄糖苷的结构多样性、鉴定、化学合成和代谢。植物化学 169：112100
6. Bramer C，Friedrich F，Dobler S （2017）通过复杂储藏室的进化，通过乳草蝽（异翅目：Lygaeinae）中的植物毒素进行防御。系统恩托摩尔 42（1）：15–30
7. Brown KK，Hampton MB （2011） 异硫氰酸酯的生物靶标。生物化学 生物物理学报 1810（9）：888–894