大家好，今天跟大家分享一篇刚被 JACS 接收的工作，文章题目是“Employing an ICT-FRET Integration Platform for the Real-Time Tracking of SO2 Metabolism in Cancer Cells and Tumor Models”。 活性硫（Reactive sulfur species，RSS） 包括谷胱甘肽（glutathione，GSH）和SO2 在生物体系中扮演重要作用。GSH是哺乳动物细胞内最丰富的的非蛋白硫醇，维持细胞内氧化还原平衡， SO2是GSH的重要代谢产物。尽管关于GSH的研究很多，但其分子机理和在活细胞内的代谢途径还有待研究。本文利用分子内电荷转移（ICT）与荧光共振能量转移（FRET）的协同作用机制，设计了一种多信号荧光探针，用于同时检测GSH及其代谢物SO2。 作为使用最多的两种传感原理， FRET与ICT被广泛用于构建比率式荧光探针，通过得到两种不同波长下荧光强度的比值，可以准确测定痕量物质。同时，对于动态跟踪过程，探针与靶标间需要设计可逆反应。香豆素由于具有摩尔吸光度高，光稳定性好，荧光量子产率高的特点可以作为能量给体。如图1所示，作者选择香豆素-氰基乙酸（CM）作为ICT体系用于研究GSH的动态过程，吸电子基团CN位于Michael受体的α碳上， 被GSH进攻时可加速亲核加成反应。为构建高效的FRET平台，作者选择苯并吡喃鎓单元（BP） 作为能量受体， 因为CM与CM-GSH的发射光谱都与BP的吸收光谱重叠，同时BP还可以作为SO2的敏感活性位点。因此，该Mito-CM-BP探针同时包括GSH与SO2 的响应位点。
图 1
如图 1d 所示，向带正电的 BP 部分中加入SO2，阻断了Mito-CM-BP的FRETI过程，并且恢复了 CM 部分的荧光发射。GSH 的存在破坏了香豆素和氰基乙酸之间的 π 共轭。同时， 受抑制的 ICT 过程触发了从 CM-GSH 供体到 BP 受体的FRET-II过程，最终导致红光增强。并且，进一步添加 SO2 会破坏 BP 部分的共轭体系，从而导致FRET-II过程受到抑制，同时供体发射释放（CM-GSH）。该探针对GSH与SO2显示出相反的荧光信号，GSH会增强红光发射信号， 而SO2导致红光淬灭。并且，在GSH的存在下，SO2会使探针的荧光信号发生蓝移。基于此， Mito-CM-BP能够可视化活细胞中 GSH 转化为SO2的代谢过程。
作者首先研究了Mito-CM-BP探针对 GSH 和 SO2 的体外传感性能。如图1d所示， Mito-CM-BP 在与GSH反应前后FRET体系不同，因此作者选择了两个激发波长488nm与405 nm，分别对应FRET-I 的给体CM与FRET-II的给体CMGSH。在激发波长488 nm 下，Mito-CM-BP 的最大荧光发射在638 nm，表明从给体CM到受体 BP 的FRET-I过程存在，且FRET效率为 44.9%。在体系中加入Na2SO3 (0–35 μM)后， 由于FRET-I过程被破坏，638 nm 处的荧光发射减弱而出现560 nm 信号（如图 2）。在 405 nm 激发波长下， 638 nm 处的最大发射信号明显降低，表明 Mito-CM-BP-SO2加成物有很强的ICT特性。该实验计算得到Mito-CM-BP 对 SO2 的检出限为 0.16 μM。用同样的方式作者考察了Mito-CM-BP对 GSH 的传感性能， 最终得到FRET-II的效率为79.2%， 对GSH的检出限为75μM。
图 2
接着作者考察了Mito-CM-BP在GSH存在的条件下对SO2的检测。如图 2g所示，随着 SO2 增加， 494 nm 处的发射信号明显增强而 638 nm 峰减弱，即发生信号蓝移。表明 Mito-CM-BP 在 GSH 存在的条件下也可以实现对 SO2 的检测，是用于监测 SO2 与 GSH 代谢过程的基础。作者进一步考察了该探针对生理条件浓度下的其他生物物质的选择性（图 2i）。 随后作者将该探针用于活细胞中 SO2 与GSH的荧光成像。MTT实验结果表明探针浓度高达 10 μM 时细胞毒性极低。光稳定性和细胞通透性实验则表明探针在 10 min 进入细胞，并且在 15 min 内与 GSH 发生反应。同时作者通过将细胞与探针和 MitoTracker Green 同时孵育 10 min 后检测到红光与绿光信号重合性好，表明该探针的线粒体位置特异性。 作者选择两种细胞HepG 2和SW480在与Mito-CM-BP预处理后加入Na2S2O3（在活线粒体内， GSH 与 Na2SO3 在硫代硫酸盐硫磺转移酶（TST） 的作用下产生 SO2， 以平衡 HSO3-/SO32-）， 其荧光信号变化如图 3 所示。红色荧光的减弱表明 GSH 的消耗，而蓝色信号先增后减则说明亚硫酸氧化酶（SUOX） 的存在，能将亚硫酸盐氧化成硫酸盐。为了进一步验证 SUOX 的存在， 作者通过 RNA 干扰降低细胞内 SUOX 水平进行相同实验（图 4）。该实验结果验证了 Mito-CM-BP具有监测活细胞内 GSH 代谢 SO2 过程的能力。
图 3
图 4
最后作者在 HepG 2 小鼠肿瘤模型中进行了 Mito-CM-BP 探针对 SO2 代谢过程的可视化研究。在小鼠中注入 Mito-CM-BP 和 GSH， 红色荧光信号迅速出现而无绿色通道信号， 进一步说明该探针可与活体 GSH 反应。而在小鼠体内注入Na2SO3， Mito-CM-BP 和 GSH，红色荧光减弱而绿色信号出现。最后作者监测这一过程中的信号变化（图 5），在注入 10 min 后红色和绿色信号最强而随后衰减，可能是由于 Na2SO3 和 GSH 增加了肿瘤区域 SO2 的浓度， SO2 随后代谢成硫酸盐。这一结果与细胞实验相吻合， 因此该探针可被用于可视化体内 SO2 的代谢过程。
图 5
综上，作者设计合成了一种双功能荧光探针用于 GSH 和 SO2 的检测，并且通过信号蓝移， 该探针还可同时检测二者的存在。该探针已被成功用于不同细胞系和肿瘤小鼠中细胞内 GSH 代谢成 SO2 的酶转化过程， 说明其可用于活体内GSH 及其代谢物 SO2 的可视化研究。同时， ICT 与 FRET 的协调作用机制对于研究不同生理过程中物质间复杂的作用关系也是一种重要策略。
原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c00992