原发性肾病综合征是儿童时期发病事仅次于急性肾炎的儿童肾脏疾病，根据病因可以分为原发性、维发性和先天性三种类型。

其中原发性肾病综合征占如同时期肾病综合征总数的约90%，人群患病串约16/10万，发病率约为2-7/10万，其发病率呈现逐年增加的趋势"。

根据对激素治疗反应的差异，可以分为激素敏感型肾病综合征(SSNS).激素依赖型肾病综合征(SSDS)和激素抵抗型肾病。

原发性肾病综合征患儿全基因组ＤＮＡ甲基化水平检测

综合征(SRNS)是指泼尼松足量治疗，4周内尿蛋白转阴者；SDNS是指对激素治疗敏感，但是连续两次减药或停药2周内复发者；SRNS则是经过足量泼尼松治疗>4周蛋白尿仍为阳性。

除外感染、遗传等因素所致病情长期无法缓解，长期大量使用糖皮质激素不可避免的出现一些副作用， 如库欣综合征、高血压、胰岛素抵抗、骨质疏松等严重影响儿童的生长发育，而联合使用免疫*制剂抑**也会增加患者感染的风险，同时加重患者的经济负担。

DNA甲基化(DNAmethylation)是在甲基化转移(DNA-nethytransferase.DNMT)的作用下，于胞嘧啶的第5位碳原子上以共价结合方式添加一个甲基，这是最早发现的一种基因表观遗传方式之一，可以存在于所有高等动物体内。

近年来，随着其研究的深入，人们发现，基因组DNA甲基化对细胞功能发挥着重要的调节作用，有研究显示，大鼠胚胎时期WTI基因异常甲基化可能是其成年期蛋白尿的重要机制之一。

而DNA的异常甲基化状态在慢性肾脏疾病的发病过程中也是普遍存在的，在一项针对慢性肾功能不全患者的研究中发现， 与肾功能急剧进展组相比，肾功能稳定组患者NPHP4IQSECI和TCF3等基因表现为高度甲基化状态，它们均参与肾脏纤维化过程中的上皮间质转化。

此外，其它一些与CKD密切相关的基因，如NOS3,NFKBIL2,cLU.NFKBIB,TGFB3和TGFBI等也表现出异常的甲基化水平，这些基因主要参与体内的氧化应激和炎症反应。

DNA甲基化作为一种疾病调控机制，在疾病发生发展过程中发挥的作用越受到重视。

原发性肾病综合征的发病机制尚未完全阐明，因此，积极探索肾病综合征的发病机制，并寻找能够早期预测激素治疗反应的生物标志对经的治疗及评估都至关重要。

儿童难治性肾病综合征基因组甲基化的生物信息学分析

甲基化芯片结果可见，难治性肾病综合征，特别是SRNS患者基因组存在广泛的异常甲基化状态。更值得关注的是，这些甲基化水平异常的基因多分布在X染色体上。

男性性染色体为XY,女性为xx,在胚胎发育时期，女性的X染色体其中一条会随机性失活，x染色体的失活通过DNACpG岛甲基化的方式实现，正常的DNA甲基化状态对X染色体失活的建立和维持具有重要的作用。

大量研究表明，x连锁遗传性疾病的表型差异与x染色体的失活有关叫，这类疾病男性患者的临床症状也通常终于女性。

因为男性仅有一条X染色体，所以X染色体上的基因异常对男性的影响大于女性，临床大样本统计也发现， 肾病综合征患病率男性高于女性，难治性肾病综合征男性患者比例较高。

基因组DNA的异常甲基化在多种肾疾病中都发挥重要的作用。肾脏纤维化是多种肾脏疾病进展到终末期的一种共同表现，因此，防止和逆转纤维化对维持肾脏正常功能具有重要的意义。

RASALI是-种Ras活性调节基因，WibkeBechel的研究就发现，该基因启动子区域的高度甲基化会促进成纤维细胞的激活，导致肾脏纤维化发生。

纤维化肾脏中RASALI基因启动子区域高度甲基化，而BMP7(bonemorphogeneticprotein7.骨形态发生蛋白7，一种抗纤维化物质)可以改善肾脏的纤维化， 这种作用是通过Tet3介导的羟甲基化反应实现的，这项发现为逆转肾脏纤维化提供了一条新的思路。

慢性肾脏疾病(chronickidncydiscase,CKD)的研究中也发现了更多DNA异常甲基化的证据，Klotho是一个衰老抑制基因，动物实验证实该基因缺失的老鼠会表现出类似人类衰老的症状， 如寿俞缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松，反之若Klotho基因高表达则可以延长实验动物寿命"。

该基因的正常表达对维持肾脏功能具有重要的作用。JingChen''等s人的研究发现慢性肾脏疾病患者肾Klotho蛋白的表达下降。 Klotho基因在尿毒症毒素诱导的慢性肾脏疾病中也存在着异常甲基化明。

在其它一些肾脏疾病中也有关于DNA异常甲基化的研究。Cosme基因是一种功能性分子伴侣，它参与IgA1分子铰链区0-糖基的合成反应明，而IgAI糖基化的异常被认为是IgA肾的重要发病机制之-R0。

有研究发现，Cosme基因启动子区域的高度甲基化会增加儿IgAN患者外周血B淋巴细胞IgAl分子的异常糖基化， 去甲基化试剂5-氮杂胞苷(5-AZA)能够逆转Cosme基因表达受抑制的情况，因此推测S-AZA具有治疗IgAN的潜能。

RNS患者尤其是SRNS患者基因组异常甲基化状态表现突出，这些患者对糖皮质激素治疗不敏感是否与基因组DNA异常甲基化有关值得关注，此前在一些关于肿瘤的研究中研究者发现部分肿瘤对化疗药物产生抵抗与DNA的异常甲基化有关。

有研究发现，在黑色素瘤中，化疗药物可以导致高表(一种组蛋白去甲基化转移酶)的低细胞周期的细胞富集，这类亚群细胞被称为肿瘤干细胞，对多种抗肿瘤药物耐药。

随后有相关研究发现KDM5B在卵巢癌中表达升高， 并且具有促进卵巢癌细胞株耐药的作用还有研究发现在顺铂耐药的卵巢癌细胞中，编码DNA错配修复酶的hMLHI基因启动子的甲基化水平升高，基因表达水平下降。

用甲基转移酶*制剂抑**处理该细胞可恢复hMLHI表达，并能部分恢复耐药细胞对顺铂的敏感性。

目前尚无研究阐明原发性肾病综合征患者对激素治疗无反应的机制， 研究证实激素抵抗型肾病综合征患者全基因组DNA存在广泛的异常甲基化状况，可以为临床研究难治性肾病综合征提供一个新的方向。

针对原发性肾病综合征患者基因组异常甲基化寻找新的治疗或检测靶点，也能够为临床工作提供巨大的帮助。

通过对激素抵抗型开病综合征患儿全基因组甲基化差异表达进行生物信息分析，我们发现这些基因涉及诸多功能，多数与细胞的基本生命功能有关。

在比较SRNS组与SSNS组可以发现，在这些差异表达的基因中，ZFY、RPS4Y1和DDX3Y被证实在儿童微小病变型肾病综合征患者外周血单个核细胞中的表达量升高2倍以上。而这些基因在SRNS组均表现为高度甲基化状态。

GO注释分析结果显示， 激素抵抗型肾病综合征患者甲基化差异表达的基因多参与调控细胞骨架、肌动蛋白等的聚合与构建的生物过程， 在GTP酶的激活过程中发挥诸多作用，同时构成多种细胞器、胸膜等。

细胞骨架蛋白对于维持肾小球足细胞的正常功能发挥着重要的作用。 在肾脏病理中处于中心位置的足细胞其特征性病变就是肌动蛋白细胞骨架的重组，进而引起足突融合、消失，使肾小球正常滤过屏障破坏，从而导致蛋白尿等一系列临床症状的发生”。

有研究发现钙调神经蛋白*制剂抑**类的药物环孢素A可以通过上调(肌动蛋白结合蛋白)分子的表达稳定足细胞的肌动蛋白细胞骨架，从而达到保护足细胞、治疗疾病的作用”。

此外，mTOR(雷帕霉素靶蛋白)*制剂抑**依维莫司也具有稳定足细胞细胞骨架的作用“.这些免疫*制剂抑**都可以用于治疗激素抵抗性肾病综合症。

细胞骨架的重排在足细胞的病理生理过程中发挥着至关重要的地位，也是目前肾脏疾病领域的研究重点。对甲基化差异表达的基因进行KEGG疾病及信号通路富集分析， 结果显示，差异表达的基因参与人体多种氨基酸的代谢，特别是能够参与药物代谢过程。

芯片结果显示UGT2B17.MAOA.MAOB.CYP2E1.UGT2B15在SRNS组表现为异常甲基化状态，通过KEGG数据库查询发现，这5个基因均能参与药物代谢通路(ha00982DrugmaboliegtocromneP450)。

在这些基因中，CYP2EI属于细胞色素P450家族成员，而细胞色素P450家肤是体内重要的药物代谢酶，主委分布在肝脏、肠道和肾脏等器官中。

它们的主要功能是代谢临床药物及外源性物质，这一系列的南可以把外源性山物、内源性物硕等转化为极性衔生物， 让这些物顺具有与目和代谢酶或者药物转运体结合的能力，从而进行下步代谢，促进其排出体外。

此前，在针对CYPs家族另成员CYP3A4的研究中，人们发现"在人的肝肚组织中CYP3A4S'规调控区域的表达，所以，近端启动子区的CpG甲基化水平能够预测CYP3A4基因表达水平。

通过比较SDNS和SS的患儿全血基因甲基化水平并进行GO分析之后，我们发现，差异基因主要涉及能量代谢、免疫过程、Rho及Ras蛋白信号传导通路、片状伪足的形成等， 其中在SDNS惠儿RGS、UGT2B15等基因表现为高甲基化，FHIT、ILI7RA.HLA等基因表现为低甲基化，分析发现这些差异表达基因与肾脏疾病的发生有密切相关性。

RGS是G蛋白信号转导调节子， 有研究表明RGS能与血管活性多肽受体结合引起Ca2+内流增加，使肾小球系膜细胞收缩导致肾小球率过滤下降”。

UGT2B是一种能够将UDP-葡萄糖醛酸的极性基团转移到内源性化合物上的转移酶，UGT2B15属于UGT2B家族， 在肝肾组织中广泛表达，对维持激素的正常代谢有着十分重要的影响"。

激素敏感性不同的人内皮细胞中，糖皮质激素受体编码基因的启动子区城的甲基化水平存在明显差异，进而影响激素受体转录翻译过程，相应细胞表达的激素受体亚型不同，从而形成细胞对激素敏感的差异性。

FHIT是一种肿瘤抑制基因，通过甲基化特异性PCR比较22对肾透明细胞癌和非恶性肿瘤的肾组织标本DNA,发现在肾癌组织，正常FHIT基因表达下降。

而5'CpG岛区城高度甲基化的FHIT表达明显增高，说明FHIT的异常甲基化和可能与肾透明细胞癌的发生有相关性。 IL-17RA是白介素-17受体A.它通过诱导固有免疫细胞的活化增殖产生免疫反应"。

有研究表明IL-17与狼疮肾炎、ANCA相关性肾小球肾炎、抗肾小球基底膜肾病"糖尿病肾病"的发生具有明显相关性。

通过对290例非糖尿病终末期肾病患者和289例健康人的1L-17上13个位点进行单核苷酸多态性分析发现， 发现ILI7E和ILI7RA能够促进终末期肾病事件的发生，其中IL-17A通过与IL.17RA结合诱导肾小管间质的纤维化促进肾病的进展。

HLA是人类白细胞抗原， 在肾病综合征患儿的表达中具有种族、性别差异，在白种人、科威特人、埃及人、法国人中HLA-DRB1407等位基因频率明显增加。

通过标准化淋巴细胞毒试验，分析37名埃及SNS患儿和100名健康儿童的HLA1类抗原，发现在SSNS惠儿HLA1I、HILA-B13、HLA-B12、HLA.B27基因频率增加。

经信号通路分析发现， 差异基因主要涉及能量物质代谢、移植排斥、抗原加工提体免疫相关的信号通路中处于关键位置。

有研究表明 HLA的异常甲基化与1型糖尿病肾病、肾细胞癌、肾病细胞瘤等肾脏系统疾病的发生发展有密切的相关。

通过GO分析，我们发现，SRNS组和SDNS组甲基化差异表达基因涉及诸多细胞生命、代谢的基本功能。

特别是KEGG疾病及信号通路的分析结果显示， 甲基化差异表达的基因参与异体移植物的排斥、移植物抗宿主疾病、自身免疫性甲状腺疾病及I型糖尿病等多种免疫相关性疾病。

大量研究表明原发性肾病综合征的发病与免疫功能紊乱有关，Th17细胞是T细胞的一种亚群，主要分泌IL-17细胞因子，而肾脏组织有丰富的IL-17因子的受体。

有研究发现， 肾病综合征患儿体内Th17细胞及调节Th17的mRNA表达均增加，这种增加可能与肾小管上皮及肾间质的损伤有关， 这种机制可能是由于IL-17调控NF-KB等途径促进肾脏固有细胞分泌IL-1B，造成肾脏局部炎症损伤。

另外，肾小球硬化时转化生长因子-β表达上调，能够刺激肾脏局部的初始T细胞ThO向Th17转化，诱导肾脏局部微环境IL-17增加，进一步造成肾脏的慢性炎症损伤及纤维化，这些都提示Th17与原发性肾病综合征的发展和预后相关。

另一种Treg细胞能够与Th17相互抑制、互为平衡，在肾病综合征发生过程中中，这个平衡被打破，出现Th17细胞表达增多，Treg细胞表达下降， 共同参与原发性肾病综合征的发生发展过程)，有研究发现原发性肾病综合征患儿外周血及肾组织中Treg细胞较对照组明显下降。

有动物实验表明给抗基底膜肾小球肾炎模型的小鼠注射CD4+CD25+Treg细胞后可以明显减少蛋白尿，提示Treg对于PNS有治疗作用，其机制可能是通过抑制炎症细胞、细胞因子等炎症介质保护了肾组织。

此外，还有诸多研究发现，体液免疫在原发性肾病综合征的发生发展过程中发挥重要的作用，有学者研究发现 NS患儿B细胞合成IgG能力欠缺，IgM向IgG转化障碍，故IgM亦增高。还有研究发现原发性肾病综合征患者IgG显著降低，C4.IgM.IgE显著升高，C3降低，IgA无明显变化””。

大部分原发性肾病综合征患儿均有IgG减少，可以导致机体存噬作用，抗体的免疫调理作用等免疫调节能力降低，抗感染能力变弱，容易出现各种井发症非影响疾病的病程甚至预后。

在对各组结果进行甲基化差异水平比较时， 发现WTIP基因在SRNS组表现为异常的甲基化水平增高。

并且在SRNS组与SSNS组比较及SRNS组与SDNS组比较时，WTIP基因高甲基化状态在两组的结果中均处于靠前位置。

WTIP为WT1相互作用蛋白， 位于人体第19号染色体上19q13.11),含有430个氨基酸，物种间高度保守， 属于含有LIM结构层(一种富含半胱氨酸的约60个氨基酸组成的保守蛋白质)的蛋白家族成员，结构中C端为三个用于蛋白之间相互作用的结构域(LIM),N端为富含浦氨酸的可以输出细胞核的结构域。

它在肾小球足细胞中则发挥着更重要的作用，研究表明WTIP表达异常可以引起足细胞形态缺陷” ，WTIP作为接头蛋白参与了nephrinNck途径介导的足细胞骨架重构和机械张力维持，在足突融合中扮演重要角色，足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分， 对维持肾小球细胞滤过功能的完整性发挥重要的作用，它的损伤在肾脏疾病的发病机制中占据重要的地位。

研究发现， 压力信号通路激活WTIP的核转位可以引起足细胞形态和动力学的改变，从而引起足细胞的损伤。

有研究显示，大鼠胚胎时期WTI基因异常甲基化可能是其成年期发生蛋白尿的重要机制之一。

对WTIP基因启动子区域进行分析后，发现共有71种细胞因子能够与其结合，其中就包括两种糖皮质激素受体GR-a和GR-B,同时也是 YY1、SP1、NF-KappaB. 等多种转录因子的结合位点，提示该区域可能是糖皮质激素起效的重要的调控元件。

甲基化修饰可以使染色质、DNA构像改变，基因表达被关闭，分析WTIP的结构和功能后， 推测它是种与糖皮质激素作用密切相关的重要的足细胞功能蛋白，激素抵抗性肾病综合征患者WTIP基因的高甲基化状态可能与患者对糖皮质激素治疗的不敏感有关， 拟在下一·步进行验证。

综上所述，儿童原发性肾病综合征患者全基因组存在着大量的异常甲基化装填， 特别是激素抵抗性肾病综合征，这些甲基化水平异常的基因可参与了组多细胞的基本生命活动， 包括能量代谢、骨架形成等，同时它们也是众多疾病信号传导通路的重要组成部分。

通过生物信息学的综合分析，我们获取了大量有价值的线索，但这些线索可靠性如何，我们将在下一步的研究中验证，并可能成为早期预测患者糖皮质激素治疗反应的生物学指标。