作者： 罗舸洋，曾东，刘建新，李多多，Howard E. Takiff，宋曙，高谦，晏博
第一作者及单位： 罗舸洋，曾东（上海医学院基础医学院/上海市公共卫生临床中心，复旦大学）
通信作者及单位： 晏博（上海市公共卫生临床中心）；高谦（复旦大学基础医学院）；宋曙（上海市公共卫生临床中心）
Temporal and cellular analysis of granuloma development in mycobacterial infected adult zebrafish
Luo G，Zeng D， Liu J，Li D，Takiff HE， Song S， Gao Q，Yan B.
J Leukoc Biol， 2023 Nov 20：qiad145.
doi: 10.1093/jleuko/qiad145.
PMID: 37982587
研究背景
结核病具有复杂的病理学和免疫学特征，肉芽肿是它的一个重要的病理诊断标志物，对其形成的病理变化过程以及免疫细胞组成的剖析有利于我们深入了解其在结核病中的功能。由于斑马鱼成鱼-海分枝杆菌感染模型能够形成与结核病人类似的肉芽肿结构，已被广泛应用于结核病中宿主免疫细胞与细菌相互作用的机制研究。但目前对于斑马鱼肉芽肿的研究大部分局限于观察坏死性肉芽肿，对于肉芽肿形成的不同阶段特征缺乏系统的描述。另外，组成肉芽肿的细胞类型复杂多样，目前常用的研究方法忽略了这些免疫细胞在其中的空间信息。因此，我们参考临床上肺结核患者不同发展阶段的肉芽肿病理特征，系统性地对斑马鱼不同阶段的肉芽肿进行描述（包括肉芽肿的形态、免疫细胞组成等）。此外，我们利用原位杂交技术在坏死性肉芽肿切片上检测几种免疫细胞的特异性空间分布。
研究方法
本研究以肺结核患者的肉芽肿发展不同阶段作为参考，系统性定义了斑马鱼肉芽肿形成的不同阶段。在此基础上，我们结合病理形态及原位杂交技术对坏死性肉芽肿中4种免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞）及其空间分布做了细致描述。通过R语言统计非坏死性肉芽肿、坏死性肉芽肿中4种免疫细胞的空间信息，确定两种肉芽肿免疫细胞的不同分布模式。
研究结果
以肺结核患者的肉芽肿发展不同阶段作为参考，系统性定义了斑马鱼肉芽肿形成的不同阶段，包括早期免疫细胞浸润、非坏死性肉芽肿和坏死性肉芽肿，偶尔能够发现早期的空洞型肉芽肿。在高感染剂量的情况下，大量巨噬细胞发生聚集、浸润的现象，通过抗酸染色可以观察到分枝杆菌开始发生明显聚集，但此时还未呈现出典型的肉芽肿细胞分层结构，在空间组织上与正常组织并无区别。在6-8 dpi（days postinfection）时，时，斑马鱼已经具备典型的球状肉芽肿结构，但无明显坏死区域，分枝杆菌也主要分布在肉芽肿内。到了9 dpi以后，肉芽肿核心出现大面积坏死，形成大量分枝杆菌聚集的干酪中心，而坏死区域周围由规则的细胞层包裹，并在空间上与正常组织之间有比较明显的间隙。原位杂交技术结果显示：在肉芽肿中，巨噬细胞以多个细胞层密集的分布在肉芽肿内侧。中性粒细胞数量相对较少，在肉芽肿中散在分布。嗜酸性粒细胞的数量也相对较少，主要在肉芽肿中靠近坏死中心处分布。淋巴细胞同样以细胞层的方式分布在肉芽肿相对外侧的位置。通过进一步对非坏死性、坏死性肉芽肿中原位杂交信号的统计，我们发现巨噬细胞在非坏死性肉芽肿中分散得比较均匀，而在坏死性肉芽肿中则更倾向于分布在肉芽肿中心；同样的，坏死性肉芽肿中的中性粒细胞也显著比非坏死性肉芽肿更多，但中性粒细胞的分布比较分散，两者并未有明显差异；嗜酸性粒细胞在坏死性肉芽肿中的数量比非坏死性肉芽肿中显著更多，但两者的分布均比较集中，坏死性肉芽肿更为明显；而淋巴细胞的数量在坏死性肉芽肿中比非坏死性肉芽肿无显著区别，但在坏死性肉芽肿中的分布更加集中。比较有意思的是，我们发现存在两种截然不同的坏死性肉芽肿：其中有一部分坏死性肉芽肿中的淋巴细胞信号数量和分布与非坏死性肉芽肿类似，而另外一部分坏死性肉芽肿则呈现出显著更多的淋巴细胞信号。
研究结论
本研究详细描述了斑马鱼肉芽肿的不同发展阶段以及不同免疫细胞的空间分布特征，将为后续更为细致的针对肉芽肿某个特定阶段及免疫微环境相关的结核病相关研究提供很好的参考。
Graphic Abstract：利用病理染色方法探究斑马鱼-海分枝杆菌感染模型中结核性肉芽肿形成的不同阶段，包括早期免疫细胞浸润、非坏死性肉芽肿、坏死性肉芽肿，偶尔能发现早期空洞型肉芽肿（上）。利用原位杂交技术探究巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞在肉芽肿中的空间分布（左下），并发现这4种免疫细胞在非坏死性肉芽肿和坏死性肉芽肿中呈现不同数量及分布模式（右下）。