来 源：陈 殊，石宣宜，顾子娴，陈家毅，蒋红霞，张 亮，孙 群，刘建群．基于代谢组学与琥珀酸/血管内皮生长因子信号通路的雷公藤煨制增效机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3851-3855.

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症和血管新生为主要病理特征，具有较高发病率与致残率。据估计，高达80%的RA患者有一种或多种并发症，从而导致寿命缩短。严重影响患者的健康和生活质量，造成了沉重的社会负担。目前，最常用于治疗RA的药物主要是改善病情类抗风湿药、新型生物制剂、非甾体抗炎药、糖皮质激素等，长期使用这些药物不良反应较多，且治疗周期较长，患者难以坚持，导致治疗效果不佳。因此，开发高效低毒的药物来治疗RA具有重要意义。

雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook. f.为卫矛科雷公藤属植物，具有祛风除湿、消除止痛、活血化瘀、解毒杀虫等功效。雷公藤自1969年来被广泛应用于RA的治疗，疗效显著，是国内治疗RA的首选单味中药。然而，雷公藤对肝、肾、心血管系统、泌尿系统、血液系统、生殖系统等有明确的损害，限制了其临床应用。本课题组前期研究发现煨制雷公藤不良反应较小，治疗佐剂性关节炎的效果显著优于生药，然而煨制对雷公藤的增效作用机制尚不清楚。

代谢组紊乱是RA发生发展过程中的重要事件，RA发病过程中会影响到代谢的多个途径，从而对机体代谢物产生影响，代谢组学可从系统生物学角度为RA的治疗提供新的思路。琥珀酸是能量代谢中三羧酸循环的中间代谢产物，其在滑膜组织中的堆积是RA有别于其他关节炎的标志，也被认为是导致滑膜病理变化的关键因素之一。研究表明，抑制琥珀酸的堆积可降低血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的产生和滑膜组织中内皮细胞的活化，抑制血管新生，从而改善RA。琥珀酸可作为一个潜在的信号分子将代谢与血管新生联系起来。基于此，本实验建立胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型以评价煨制前后雷公藤治疗RA的疗效差异，同时基于代谢组学与琥珀酸/VEGF炎症信号通路共同探讨雷公藤煨制抗RA的增效作用机制。

CIA模型是一种经典的临床前模型，与人类RA的发病机制最为相似，是目前公认研究RA病理机制和评价治疗药物的最佳动物模型。模型大鼠的足肿胀程度和关节滑膜病理形态学的改变可以反映药物的疗效和作用强度，常用于药物有效性评价和药物筛选。IL-1β是与RA的发生发展过程中关系密切的促炎症细胞因子，在RA患者及CIA大鼠血清中的水平显著高于健康组。本研究发现RTE可明显降低CIA大鼠足肿胀程度、关节炎评分、血清中IL-1β水平，改善关节滑膜增生和炎性细胞浸润，且效果显著优于TE，说明煨制对雷公藤具有确切的增效作用。

1 代谢组学分析

代谢组学是一种可在机体内快速筛选药物疗效或毒性的系统生物学技术，采用“自上而下”的策略，在整体环境中反映生物系统代谢网络的最终症状，与中药治病整体性、动态性原则极其相似，可为评估中药的疗效和机制提供一种新思路。

本研究基于代谢组学技术分析了雷公藤煨制前后对CIA模型大鼠的尿液代谢产物的影响，共筛选出15个潜在的RA生物标志物，其中5-羟基吲哚乙酸、尿苷5′-单磷酸、肌酸、白三烯B4、 N -乙酰色氨酸据以往的报道证明为可靠的RA生物标志物，对于疾病的发生具有重要意义。而 ( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸、环状 N -乙酰羟色胺葡萄糖醛酸苷、β-胍基丙酸、 N -棕榈酰色氨酸、5-甲酰胞嘧啶在以往的研究中鲜有报道，为本研究新发现的RA相关生物标志物。在TE组中鉴定出9个与抗RA相关的生物标志物，在RTE组鉴定出6个与抗RA相关的生物标志物。

通过对比分析发现，RTE组中的6个抗RA生物标志物与TE组高度重合，且与TE组相比明显更向CON组回调。代谢通路分析显示，TE和RTE均通过调节缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，能量代谢，色氨酸代谢，花生四烯酸代谢发挥抗RA作用，煨制增效的机制可能与调控这些途径有关。

( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸是一种短链酮酸，参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成代谢途径，其中主要影响异亮氨酸的生物合成。异亮氨酸是一种支链氨基酸，研究显示支链氨基酸可以刺激肿瘤坏死因子、细胞因子（如IL-1β）的产生，这与本研究中CIA大鼠血清中IL-1β升高结果一致。此外，异亮氨酸可以影响5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）前体物质的运转，造成中枢神经的疲劳，这与本研究中模型大鼠神态疲倦相符合。

本研究中，与CON组相比，MOD组中 ( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸含量显著下降。( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸含量的变化影响了异亮氨酸的合成，从而刺激了CIA大鼠相关因子与5-HT前体物质，引发了炎症反应和关节破坏，造成了机体的疲乏感。在给予TE和RTE后，( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸含量较CON组显著上升。说明TE和RTE可以通过调节缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成抑制RA的炎症反应。

5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）是5-HT的分解产物，参与色氨酸代谢中的5-羟色胺途径。当机体处于炎症状态时中或细胞受到损伤后，5-HT会被释放并通过单胺氧化酶和醛脱氢酶转化为5-HIAA。研究发现，佐剂性关节炎大鼠血清中5-HIAA水平显著上调。

在本研究中，致炎的大鼠体内大量5-HT被释放转化为5-HIAA并随尿液排出，导致MOD组大鼠尿液中5-HIAA含量显著上升。TE和RTE干预后，抑制了5-HT的释放，减少了5-HIAA的产生，导致尿液中的5-HIAA含量较MOD组显著下降。 N -乙酰色氨酸是肠道微生物群产生的色氨酸的分解代谢物。研究发现，RA患者存在色氨酸代谢异常，体内 N -乙酰色氨酸含量与RA发病率有关。本实验中MOD组较CON组 N -乙酰色氨酸的含量变化说明了CIA大鼠体内的色氨酸代谢被扰乱，而TE和RTE通过回调 N -乙酰色氨酸水平来改善色氨酸代谢异常，从而发挥治疗作用。

在许多疾病的过程中，随着炎症的发生和发展，体内能量的消耗会反映在代谢产物中。肌酸是一种含氮氨基酸，在机体内由精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸3种氨基酸所合成。肌酸可在肌酸激酶的作用下形成磷酸化肌酸，参与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）循环，在细胞内能量的转运过程中具有重要作用。现代医学认为RA患者关节局部存在低氧、缺氧和低血糖状态，低氧导致氧化磷酸化途径ATP的生成障碍。在CIA大鼠中，低氧导致肌酸通过氧化磷酸化途径生成ATP的过程受到阻碍，能量反应受到抑制，从而导致肌酸在机体内的含量升高。在经TE和RTE治疗后，肌酸含量明显较MOD组下降，提示TE和RTE可能通过调节能量代谢发挥抗炎作用。

白三烯B4是一种炎症脂质介体，可激活并且聚集多种炎性和免疫效应细胞，作用于T淋巴细胞释放各种细胞因子。研究发现，在RA机体中含有较高浓度的白三烯B4，并且中性粒细胞释放白三烯B4的能力增强。白三烯B4通过抑制中性粒细胞凋亡并诱导其定向迁移、致关节疼痛过敏、调控免疫细胞分化和细胞因子表达等引发RA病人关节肿痛、骨质破坏等炎症反应。本实验中MOD组大鼠尿液中白三烯B4含量显著升高，与文献一致。经TE和RTE治疗后，白三烯B4含量显著下降，提示TE和RTE通过调控白三烯B4在体内的代谢和转化从而下调炎症因子的释放，进而发挥对CIA大鼠的治疗作用。

尿苷5′-单磷酸是一种单磷酸盐形式的尿嘧啶核苷酸，能够由从头途径或体内核苷酸和核酸的降解产物获得。在RA患者的关节中有大量活化的T细胞，它们需要大量嘧啶以维持其增殖。研究表明，在佐剂性关节炎模型大鼠中尿苷5′-单磷酸含量显著降低，是潜在的RA生物标志物。本实验结果与文献一致，可能是活化的T细胞的增殖消耗了大量嘧啶，导致其含量的下降。

2 对琥珀酸/VEGF炎症信号通路的影响分析

RA的发病机制目前尚不明确，关节滑膜炎症和血管新生是其基本病理特征。血管新生发生在炎症关节组织的早期，可以促进炎性细胞向关节的浸润，在RA的发展中起着重要作用。VEGFA作为效果突出的促血管生成因子，在RA滑膜组织中高表达，可促进滑膜内皮细胞活化以诱导炎症，从而在RA中建立血管新生和关节炎症之间的相互作用。炎性介质CD31被视为内皮细胞和血管细胞的表面分子标志，主要高表达于血管内皮细胞的胞质中，在血管的生成中起到重要的作用。在本研究中TE和RTE可明显下调VEGFA和CD31的表达，RTE下调的趋势较TE更加明显，提示雷公藤可调节血管新生改善RA，煨制增效作用与血管新生有关。

琥珀酸是能量代谢中三羧酸循环的中间产物，可由SDH水解为富马酸。研究表明，琥珀酸在RA患者关节滑膜液中大量堆积可加剧关节滑膜炎症和血管新生，阻断琥珀酸在滑膜中的堆积可抑制血管新生和滑膜炎症，从而改善RA。本实验发现TE和RTE均可抑制模型大鼠的琥珀酸堆积，煨制品抑制效果显著优于生品。在三羧酸循环中抑制SDH活力会导致琥珀酸过度堆积。然而本研究中CIA大鼠中SDH活性显著高于健康大鼠且雷公藤煨制前后大鼠滑膜中SDH活性、富马酸含量无显著差异。结合文献发现，琥珀酸的积累可能是SDH活性逆转的结果。而雷公藤并未参与对SDH活性的调控，煨制增效机制也与SDH活性无关。

综上，煨制可有效提高雷公藤对CIA大鼠的治疗效果，其增效机制与调节缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，能量代谢，色氨酸代谢有关。在与RA发病相关的差异代谢物中，5-羟基吲哚乙酸、尿苷5′-单磷酸、肌酸、白三烯B4、 N -乙酰色氨酸经文献研究证明为可靠的RA生物标志物，对于疾病的发生具有重要意义。而 ( S )-2-乙酰-2-羟基丁酸、环状 N -乙酰羟色胺葡萄糖醛酸苷、β-胍基丙酸、 N -棕榈酰色氨酸、5-甲酰胞嘧啶在RA的研究中鲜有报道，为本研究新发现的RA相关生物标志物。

经进一步的研究发现，雷公藤可调节琥珀酸/VEGF炎症信号通路阻止琥珀酸堆积和抑制血管新生，从而改善RA，煨制可增强雷公藤对该信号通路的调控从而发挥增效作用。本研究首次从代谢组学的角度及琥珀酸/VEGF炎症信号通路阐释了煨制雷公藤抗RA增效机制，为煨制在雷公藤中的应用提供了科学依据，为雷公藤的深入研究提供了参考。