胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是最普遍及侵袭性最强的一类形式。研究表明，全球每10万人就有0.59～3.69人患病[1]，中位生存期仅有15个月[2]。目前标准治疗方式主要是手术及放疗或化疗，同时口服替莫唑胺。然而替莫唑胺治疗受到获得性化学抗性的限制，并不能很好地控制脑胶质瘤的转移，5年生存率低于5.5%[3]。因此，开发GBM的新疗法成为现代神经科学和肿瘤学最首要的任务之一。

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。已有研究证实，青蒿琥酯具有治疗GBM的潜能[5-6]，但对于抗GBM的机制研究尚不充分。随着对表观遗传学的深入研究，DNA甲基化测序技术也逐渐成熟并被运用到研究多种疾病进展的分析中。研究表明，DNA甲基化在维持细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤的发生中起着重要作用。

截至目前，大多数关于GBM表观遗传改变的研究都指出了DNA甲基化的作用，如全基因组低甲基化、基因特异性低甲基化和高甲基化[7]。此外，关于GBM的表观遗传学研究发现，表观遗传学修饰与其生物学特征和治疗靶点相关[8]。基因启动子甲基化等遗传生物标志物是GBM患者重要的预后影响因素，被认为是患者治疗和预后的重要靶点[9]。因此，本研究基于给予青蒿琥酯前后人脑星形胶质母细胞瘤U87细胞和人胶质瘤U251细胞2种细胞模型，进行药效观察和细胞功能实验，结合DNA甲基化和网络药理学分析，从表观遗传学层面探讨青蒿琥酯干预GBM的分子机制，为GBM的治疗提供新思路。

1 青蒿琥酯对U87细胞的抑制作用强于U251细胞

如图1所示，给药24 h后，青蒿琥酯对U87细胞的IC50为22.69 μg/mL，而对U251细胞的IC50则大于180 μg/mL。与对照组比较，18 μg/mL的青蒿琥酯在给药10～24 h后，对U87细胞增殖有显著抑制作用（ P ＜0.01、0.001）；而180 μg/mL的青蒿琥酯在给药10 h后，可抑制U251细胞增殖（ P ＜0.001）。细胞活性和增殖实验结果显示，青蒿琥酯可抑制2种GBM细胞，与U251细胞相比，青蒿琥酯对U87细胞更为敏感。

2 青蒿琥酯可阻滞U87和U251细胞周期

如图2所示，与对照组比较，22.69 μg/mL青蒿琥酯处理后，U87细胞的G2/M期的细胞数量增加6.2%；180 μg/mL青蒿琥酯处理后，U251细胞的S期和G2/M期细胞数量均增加，且S期细胞数量增加具有显著性差异（ P ＜0.05）。表明青蒿琥酯可抑制U87细胞的G2/M期，以及U251细胞的S期和G2/M期。相比于U251细胞，较低剂量的青蒿琥酯更能将U87细胞阻滞在G2/M期，通过阻止细胞快速增长来抑制GBM细胞的活性。

3青蒿琥酯可促进U87和U251细胞的自噬

采用qRT-PCR检测经180 μg/mL青蒿琥酯处理后U87和U251细胞的自噬标志分子（ Beclin1 、 LC3 、 p62 ）mRNA表达水平，如图3-A所示，180 μg/mL青蒿琥酯处理后，U87细胞中 Beclin1 、 p62 、 LC3 mRNA表达水平均显著升高（ P ＜0.001），而U251细胞中仅 p62 mRNA表达增加（ P ＜0.05）。Western blotting结果（图3-B）显示，11.35 μg/mL的青蒿琥酯显著升高U87细胞中LC3B蛋白表达水平（ P ＜0.05），22.69 μg/mL的青蒿琥酯显著升高U87细胞中Beclin1蛋白表达水平（ P ＜0.05），45.38 μg/mL的青蒿琥酯显著升高U87细胞中p62蛋白表达水平（ P ＜0.05），180、360 μg/mL的青蒿琥酯可使U251细胞中Beclin1、p62、LC3B蛋白表达趋势升高，但无显著性差异。

4甲基化和去甲基化基因分布

前期的药效和细胞功能实验结果显示，青蒿琥酯对U87细胞较为敏感，而对U251细胞耐药，为了探究青蒿琥酯在治疗GBM中发挥药效的机制以及产生耐药的原因，本研究将给药前后的U87与U251细胞进行甲基化测序与分析，选取启动子区域进行甲基化数据分析。筛选U87和U251 2种细胞的差异基因数（U87 vs U251），得到“U87与U251细胞差异基因集”；筛选2种细胞给予青蒿琥酯前后的差异基因数（U87 vs U87-ART、U251 vs U251-ART），得到“青蒿琥酯干预U87细胞效应基因集”以及“青蒿琥酯干预U251细胞效应基因集”。

如图4所示，U87 vs U251*共中**有226 058个差异基因，其中包括61 891个甲基化基因和164 167个去甲基化基因；U87 vs U87-ART*共中**有3345个差异基因，其中包括3294个甲基化基因和51个去甲基化基因；U251 vs U251-ART*共中**有420个差异基因，其中包括243个甲基化基因和177个去甲基化基因。

通过对各组的差异基因进行功能富集，选取富集度最高的前10个通路进行功能模块富集，主要富集到6大功能模块。包括代谢、遗传信息、环境信息、细胞过程、有机系统以及人类疾病。其中U87 vs U251主要富集到了代谢（包括药物代谢-细胞色素P450信号通路）和细胞功能、人类疾病[包括癌症相关、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）相关信号通路]功能模块；U87 vs U87-ART主要富集到了代谢、环境信息（细胞外基质-受体相互作用信号通路）、细胞功能（自噬、黏着连接信号通路）、有机系统等功能模块；U251 vs U251-ART主要富集到了代谢、遗传信息（基因复制、同源重组信号通路）、细胞功能（细胞凋亡相关信号通路）等功能模块。根据以上信息，初步表明青蒿琥酯具有干预GBM的潜能。

5 青蒿琥酯干预GBM的核心靶点筛选

5.1 差异基因筛选

选取启动子区域甲基化数据，根据adj. P 和∆β，筛选青蒿琥酯干预GBM效应基因以及青蒿琥酯敏感型和耐药型细胞系差异基因。U87 vs U251*共中**有1881个差异基因，其中包含893个甲基化基因和988个去甲基化基因；U87 vs U87-ART*共中**有342个差异基因，其中包含181个甲基化基因和161个去甲基化基因；U251 vs U251-ART*共中**有56个差异基因，其中包含26个甲基化基因和30个去甲基化基因。

差异基因筛选数据可见，U87和U251 2类细胞差异基因数以及青蒿琥酯给药前后U87细胞差异基因数较多，而青蒿琥酯给药前后U251细胞差异基因数较少，这与青蒿琥酯对U87细胞较敏感，而对U251细胞耐药的体外实验结果相呼应。

5.2 核心靶点预测

基于STRING v10.0软件，挖掘“U87与U251细胞差异基因集”、“青蒿琥酯干预U87细胞效应基因集”以及“青蒿琥酯干预U251细胞效应基因集”各自的相互作用关系。如图5-A所示，U87 vs U251中包含1016个节点和2353对相互作用；U87 vs U87-ART中包含288个节点和160对相互作用；U251 vs U251-ART中包含53个节点和4对相互作用。

运用Cyto Hubba v0.1分别计算PPI网络中各节点的网络拓扑特征值（度值、最大集团中心、介数中心性和接近中心性），筛选4者均大于相应中位数的节点为关键网络靶标，共得到290个U87 vs U251核心靶点（最大集团中心为4、度值为4、接近中心性为203.6、介数中心性为1 220.3）和53个U87 vs U87-ART核心靶点（最大集团中心为2、度值为2、接近中心性为13.6、介数中心性为0）。

6 核心靶点的富集分析

基于DAVID v6.8数据库，对青蒿琥酯干预GBM效应基因以及青蒿琥酯敏感型和耐药型细胞系差异基因的关键网络靶点进行KEGG信号通路富集分析。生物功能富集结果显示，U87 vs U251核心节点共富集到23条信号通路（ P ＜0.05），包含神经系统相关通路以及与调节细胞功能和免疫-炎症反应相关的信号通路；U87 vs U87-ART核心节点共富集到2条信号通路（ P ＜0.05），分别是Janus激酶（Janus kinase，JAK）-信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信号通路和自然*伤杀**细胞介导的细胞毒性信号通路（图5-B）。其中，与细胞增殖分化密切相关的JAK-STAT信号通路为共同富集通路，对富集到该通路的基因进行分析。

分析结果显示，该条通路上的基因 PDGFRA 与GBM密切相关，该基因发生突变后会促进肿瘤的恶性进展。进一步文献调研发现PDGFRA和BRAF普遍在GBM患者发生突变。甲基化数据结果也显示， PDGFRA 和 BRAF 基因在U87 vs U87-ART中被甲基化沉默（adj. P ＜0.05），且均与GBM的发生发展有关。

7 青蒿琥酯与关键靶点的分子对接结果分析

采用AuotDock和AutoDock Vina 2种对接方法考察青蒿琥酯与关键靶点BRAF和PDGFRA的结合能力。如图6所示，青蒿琥酯与BRAF蛋白的结合能分别为−22.06、−31.4 kJ/moL，青蒿琥酯与PDGFRA蛋白的结合能分别为−24.58、−34.75 kJ/moL，由此看出，青蒿琥酯与BRAF和PDGFRA这2种蛋白的结合能力较强。

8 青蒿琥酯对关键靶点的蛋白表达影响

为了验证青蒿琥酯对BRAF和PDGFRA 2种蛋白表达的影响，用11.35、22.69、45.38 μg/mL的青蒿琥酯处理U87细胞，90、180、360 μg/mL的青蒿琥酯处理U251细胞，采用Western blotting进行检测，如图7所示，11.35、22.69、45.38 μg/mL的青蒿琥酯均可降低U87细胞中PDGFRA蛋白表达水平（ P ＜0.05、0.01），11.35、45.38 μg/mL的青蒿琥酯可降低BRAF蛋白表达水平（ P ＜0.01）；90、180、360 μg/mL的青蒿琥酯对U251细胞中PDGFRA蛋白表达无显著影响，90 μg/mL的青蒿琥酯可显著降低BRAF蛋白表达（ P ＜0.001）。

讨论

脑胶质瘤作为一种中枢神经系统的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，因部分临床患者存在化疗耐药性，且肿瘤抑制因子和癌基因的多重功能障碍的存在使其成为最难治疗的恶性肿瘤之一[10]。目前主要存在预后差及复发率高等问题，亟需挖掘新的抗GBM治疗药物。本研究基于2种GBM细胞U87和U251的药效实验和甲基化数据分析，旨在探讨具有抗肿瘤活性的一类青蒿素衍生物青蒿琥酯发挥抗GBM的药效，并初步挖掘其作用机制以及临床产生耐药相关的分子机制。

细胞活性和增殖结果显示，青蒿琥酯对U87细胞的抑制作用比U251细胞强；中、高剂量的青蒿琥酯从早期开始即可抑制U87细胞的增殖，而仅有高剂量青蒿琥酯才能影响耐药型细胞U251的增殖。此外，高剂量青蒿琥酯可阻滞U87和U251脑胶质瘤细胞周期分布，低、中、高剂量青蒿琥酯促进U87细胞3种自噬标志分子（Beclin1、p62、LC3）的表达，而仅有中、高剂量才能影响U251细胞的自噬标志分子表达。以上实验表明青蒿琥酯对U87细胞敏感，而对U251细胞耐药。

为进一步揭示青蒿琥酯在治疗GBM中发挥药效的分子机制和潜在的耐药机制，本研究将给药前后的U87与U251细胞进行甲基化测序与分析，筛选出的核心靶点显著富集于癌症、细胞增殖、凋亡相关通路，其中青蒿琥酯干预GBM的关键靶标显著参与了PDGFRA-大鼠肉瘤基因（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）-BRAF-丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路。甲基化数据显示，青蒿琥酯给药后，该通路上的PDGFRA和BRAF被甲基化沉默，导致其转录和表达受到抑制，进而阻止下游RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的激活。

青蒿琥酯与蛋白质PDGFRA和BRAF的分子对接结果显示青蒿琥酯与2种蛋白质有较好的结合能力。Western blotting结果证实青蒿琥酯可以抑制PDGFRA和BRAF 2种关键蛋白在U87和U251细胞中的表达。

研究表明，GBM的恶性进展可能与PDGFRA的过表达有关[11]。PDGFRA作为细胞表面受体，在调节胚胎发育和细胞增殖中起着重要的作用，可介导RAS的激活[12]。此外，G34R/V型胶质瘤（G34R/V HGGs）中PDGFRA的高激活突变，可观察到明显的ERK磷酸化，表明下游有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/ERK途径被激活，促进了肿瘤的发生[13]；在GBM细胞中，具有GTP酶活性的RAS蛋白被上游PDGFRA激活后，通过与BRAF的 N 端结构域结合使BRAF活化，参与恶性肿瘤的形成和发展。

此外，其突变也与许多癌症类型的预后不良有关[14]。突变使BRAF蛋白持续激活，磷酸化MEK，从而诱导MAP激酶信号转导途径，并持续作用于下游的唯一底物ERK进入细胞核，通过影响DNA和蛋白质合成以及细胞周期进入来促进细胞增殖和分化[15]，其中ERK2还可以通过调节线粒体来促进肿瘤生长[16]。相关研究表明，抑制MAPK/ERK通路可以逆转阿霉素对乳腺癌的耐药性[17]。因此，推测青蒿琥酯缓解GBM可能通过调节PDGFRA的表达，从而抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK信号通路；或通过直接抑制BRAF及其下游MEK-ERK途径，即青蒿琥酯可通过上述2条途径切断MEK-ERK的信号传导，从而阻止GBM细胞的增殖扩散发挥治疗作用（图8）。

目前临床前已有多种有效药物靶向GBM中的PDGFRA，包括酪氨酸激酶*制剂抑**达沙替尼，然而，达沙替尼的单药治疗未能改善成人高级别胶质瘤（high- grade gliomas，HGG）的结局[18]；此外，BRAF*制剂抑**维莫非尼以及达拉非尼也具有抗GBM活性[19-21]。临床上单纯抑制PDGFRA或BRAF对GBM的疗效有限，而青蒿琥酯不仅可抑制PDGFRA，还可进一步作用于BRAF，具有治疗GBM的潜能。

综上所述，本研究结合药物对2类GBM细胞的体外实验和甲基化数据分析，发现青蒿琥酯可能通过抑制PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK途径，发挥抑制GBM细胞的生长和扩散的治疗作用。研究结果不仅为GBM提供潜在新的治疗方案，也为临床中GBM患者对药物产生耐药的机制探索提供方法学参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：闫向英，毛 霞，李 涛，Koji Mizuno，Katsuki Okuyama，林 娜，张彦琼，Takashi Sato．基于DNA甲基化测序技术研究青蒿琥酯干预脑胶质瘤的分子机制 [J]. 中草药, 2023, 54(6):1814-1824.