基因疗法是全球突破性技术之一，《科学》杂志公布的2020年十大科学突破中也有基因疗法的身影：通过CRISPR技术，首次在临床上成功治疗了两种遗传性血液疾病。
基因疗法的研究范围远远超出了传统药物，已成为治疗单基因遗传疾病的重要新方法。但基因疗法的研究还面临着许多挑战，如安全性、伦理等都是学界和社会关注且亟需解决的问题。
目前已知的人类遗传病超过6000种，单基因遗传病有3200种，其中 95%以上的遗传疾病都无有效的治疗方法 。
通过近50年的研究，临床试验和治疗效果均证明了基因疗法可以为单基因遗传疾病患者提供新的治疗选择。
基因疗法
基因疗法指 将外源正常基因导入靶细胞 ，纠正或补偿缺陷和异常的基因，以达到根治疾病的目的。
基因疗法的策略有以下两种：
基因疗法的两种策略示意
体内基因疗法（in vivo therapy）
将含有修复基因片段的病毒载体或非病毒载体通过 对患者进行局部或全身注射的方式 转移到患者体内，基因以 整合的方式 插入到患者的染色体上进行基因修复，或以 非整合的方式 传递给长期处于有丝分裂或缓慢分裂的细胞以完成DNA在染色体外稳定表达。
此疗法的整个编辑过程 在体内进行 ，治疗中需要编辑方法和工具准确、高效，且需要确保病 毒载体对人体无害 。
回体 基因疗法（ex vivo therapy）
将 细胞从患者体内分离 ，将基因导入目的细胞，使基因定位到患者细胞染色体中的1个或多个位点上，实现 转入基因的持续表达 ，再将改良后的细胞输回患者体内。
此疗法对目的细胞的遗传改造 在实验室中进行 ，编辑效率较低，但可以 筛选出正确改造的细胞 进行扩大培养，当细胞达到一定数量后再输回患者体内。
正确改造的细胞必须有 足够大的数量 、 可逃避免疫识别 、能够 长期存活 或者可将修饰的基因 传给其后代 以维持后代基因的正常表达。
基因疗法载体系统及基因编辑技术
基因疗法的载体系统是将外源基因递送到细胞的工具，决定了基因运载的有效性。
病毒载体
基因疗法中最常用的病毒载体主要包括逆转录病毒（retro virus，RV）和慢病毒（lenti virus，LV）、腺病毒（adeno virus，AdV）以及腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）。
RV是第一个被证明可以 将基因传递到造血干细胞 （hematopoietic stem cells，HSCs）中的载体，属于 整合型病毒载体 ，可以编码逆转录酶，将病毒的RNA逆转录成DNA。
简单的RV（根据基因组结构划分） 仅能感染分裂细胞 ，有一定的局限性和风险性。
LV是一种 具有复杂基因组的逆转录病毒 ，通常在宿主体内引起 迟发性疾病 ，是以人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）为基础发展起来的、用于 体内基因传递 的载体，可感染分裂细胞和非分裂细胞。
目前，LV载体可 在多代中 实现有效的基因转移和稳定基因表达，是 大多数HSCs基因疗法的首选工具 。
AdV是 无包膜的双链DNA病毒 ，可以感染分裂细胞和非分裂细胞， 表达持续时间很短 ，易导致人类的呼吸道感染。
AdV属于 非整合型的病毒载体 ，不会因为将基因片段整合到宿主基因组而造成抑癌基因失活，但容易引发机体产生 较强烈的免疫反应 。
AAV是该领域相对较新的、简单的、无致病性的 单链DNA病毒 。
AAV载体衍生自细小病毒，属于 非整合型的载体 。野生型AAV载体具有一个小的单链DNA基因组， 需要另一种病毒 才能进行复制。
AAV具有 免疫原性弱 、 转染效率高 、 可转染非分裂细胞 、 表达稳定且持续时间长 、 可降低与基因整合有关的风险 等优点，但其 容量小 、不能包装超过5.0 kb的DNA，导入的基因以游离状态存在，在细胞分裂过程中基因 容易丢失 。
重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，被视为 最有前途的基因转移载体之一 ，针对不同的靶组织可以考虑选择不同血清型的rAAV。
非病毒载体可 根据需求合成或定制 ，也可进行各种表面修饰以产生 理想的靶向特性 ，还具有 可大量制备 ， 免疫反应低 、 可传递大量基因 的优势。
其中最简单的是 裸“DNA” ，即将DNA直接注入人体，但基因传递效率偏低。
脂质体 和 聚合物 作为潜在的基因疗法传递系统受到了广泛关注，此外还有分子偶联受体、复合载体及纳米粒子载体等。
基因编辑
基因编辑技术是以 改变目的基因序列 为目的，实现 定点突变、插入或敲除基因 的技术，可以在离体细胞上进行，也可以在机体内进行原位基因组编辑。
常见的是人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术，主要包括4种：
1）大范围核酸酶技术（meganuclease）
识别特定 较大（12~40 bp）DNA序列 的序列特异性DNA切割酶或核酸内切酶，也称为 归巢核酸内切酶 。
2）锌指核酸酶技术（zinc finger nuclease，ZFN）
由识别和结合特定的DNA序列重复的 锌指蛋白 和通过二聚体化非特异地切割DNA的FokI限制性核酸内切酶的 核酸酶结构域 组成。
3）转录激活因子样效应物核酸酶技术（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）
由特异性转录激活因子样效应物蛋白和植物病原体，以及源自FokI限制性核酸内切酶的核酸酶结构域组成。
4）成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系统：
Cas9蛋白来源于 酿脓链球菌 ，由负责 切割靶向链RuvC 和负责 切割与sgRNA互补配对的非靶向链HNH 两个重要结构域组成。
基因疗法中病毒载体介导基因递送细胞的过程以及基因编辑示意
基因组编辑技术被称为“精确的手术刀”，为实现基因校正或改变基因组提供了更多的可能。
基因编辑技术也逐步向更加精准的方向发展， 单碱基编辑（base editor，BE）技术 的出现扩大了点突变基因编辑的使用范围。
但基因组编辑技术处于临床初期，存在许多临床应用的可行性和安全性障碍。
单基因遗传疾病基因疗法取得突破性进展
目前，脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）、Leber先天性黑蒙（Leber's congenital amaurosis，LCA）、血友病（hemophilia）、β-地中海贫血（β-thalassemia）这4种单基因疾病的9种基因疗法已分别取得美国食品药品监督管理局突破性疗法资格、欧洲药品管理局的优先药物资格或者已经批准上市。具体药物见下表。
脊髓性肌萎缩症与基因疗法
SMA是一种 常染色体隐性遗传疾病 ，由于 运动神经元存活基因1 （survival motor neuron1，SMN1）不能编码运动神经元存活所必须的蛋白质，引起前角细胞变性，进而导致 进行性肌无力或肌萎缩 。
发病率约为 1/10000 ，携带频率为 1/54 。SMA根据发病年龄和严重程度分为5种主要类型（0~IV型）。
可用于治疗SMA的 Nusinersen 是一种反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO），仅能采用 鞘内注射 的方式进行治疗，且需要 频繁给药 。
另一种基因疗法 Zolgensma （亦称作AVXS-101）为 携带SMN1基因的AAV9 （scAAV9.CB.SMN），能有效穿过血脑屏障，有望 通过单次注射达到治愈脊髓性肌萎缩症 ，不良反应主要是全身 施用 AAV载体引起的 氨基转移酶水平升高 ，对于有 肝脏损伤 的患者有更高的风险。
Leber先天性黑蒙2型与基因疗法
LCA由基因突变（19个不同基因中的 任何一个突变 都可能导致Leber先天性黑蒙）引起婴儿视网膜营养不良而发病，是一种 罕见的视觉破坏性疾病 ，患病率为1/50000~1/100000。
其中，LCA2型是视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞中 RPE65基因 突变造成的，约占所有LCA患者的6%。
重组AAV2.hRPE65v2 是一种载有RPE65cDNA的AAV载体，体外实验中可 诱导靶细胞产生RPE65蛋白 。动物实验中，注射AAV2.hRPE65v2可使LCA2型动物模型的 视觉功能迅速发展 。
Luxturna 是FDA批准的首种可直接 针对某个特定基因突变性疾病 的基因疗法。
其他LCA2型多项基因疗法正在进行I/II期临床试验。
血友病与基因疗法
血友病是由 凝血因子VIII（F8）或IX（F9）缺乏 引起，分别导致血友病A（hemophilia A，HA）或血友病B（hemophilia B，HB），发生概率分别为 1/5000 和 1/30000 ，严重的患者的特征是FVIII/FIX活性（FVIII：C/FIX：C） 低于正常水平的1% 。
血友病B的治疗中，AAV作为载体的基因疗法能在人体中维持较长时间且相对稳定地表达FIX，实现患者 由重型到轻型的转换 。此外，FIX基因异位表达对血友病B的 调节作用 也取得了一定的研究进展。
目前，已有多项血友病A和血友病B的基因疗法进行I/II期临床试验以及开放式III期试验。
β-地中海贫血与基因疗法
β-地中海贫血是由 β+降低 或 β0的缺失 导致由2个α-珠蛋白链和两个β-珠蛋白链（α2β2）组成的 血红蛋白（hemoglobin，Hb）四聚体合成受影响 ，可分为：轻型地中海贫血（临床上无症状）、中型地中海贫血和重型地中海贫血。
全球约有 8000万~9000万 人是β-地中海贫血携带者，每年约有6万名有症状的新生儿出生现阶段，β-地中海贫血采用 回体基因疗法 进行治疗。
结论
基因疗法已成为治疗单基因遗传疾病的重要新方法，可以借助载体靶向组织递送正确的基因， 促进正常的基因持续调节表达 ；或者将细胞转变为靶向基因传递的 智能载体 ，满足遗传类疾病或其他罕见病的医疗需求。
但基因疗法仍然存在许多挑战，包括：增加基因转移载体的 安全性 、使载体 精确地靶向组织 、 提高基因转移或编辑效率 、 降低基因组编辑的遗传毒性 等。
更重要的是，基因组编辑的 伦理学 已成为医学、社会学、立法者和公众共同关心的问题，需要达成社会共识。
本文作者： 周丽娟，王京春，高宏斌，赵东平 作者简介： 周丽娟，中国科普研究所，中国科学院科技战略咨询研究院，博士后，博士阶段研究方向为药物筛；王京春（通信作者），中国科普研究所，研究员，研究方向为科学传播及科学素质测评。
论文全文发表于《科技导报》第22期
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