引言

神经元的电活动具有跨越三个数量级的时空足迹，传统的电生理学缺乏空间吞吐量，无法成像整个神经网络的活动。

使用标记的电压敏感染料和追踪Ca2+离子动态的光学成像方法分别缺乏捕捉快速尖峰活动的多功能性和速度。

提出了一种无标记的光学成像技术，使用超快极化敏感离轴全场光学相干显微镜，以4,000 Hz的速度在200×200 μm^2区域内成像神经活动引起的光路长度和局部双折射的变化，并具有微米级空间分辨率和300 pm的位移灵敏度。

哺乳动物神经元活动引起的光学响应中的波动与场电位电生理测量相匹配，并通过通道阻滞剂进行了验证，通过直接跟踪毫秒时间尺度和微米分辨率下的广域神经活动，SPoOF OCM为从低吞吐量的电生理学发展到高吞吐量的超并行无标记光生理学提供了一个框架。

• 超快速极化敏感光学显微镜揭示神经活动的时空特征

提高神经生理学工具的吞吐量对于理解神经电路和神经系统具有深远影响，工程化工具以观察神经环境的原生状态具有挑战性，因为神经活动模式在空间和时间上跨越三个数量级。

无论是在单细胞还是网络尺度上，神经活动可以持续几毫秒，如短暂的尖峰动作电位，到几秒钟，如突触电流的变化或复杂信号级联的响应。

通常通过将电极插入或靠近细胞来测量单个神经元的电流，较大的多细胞尺度上的神经元活动是通过使用功能性磁共振成像来推断血流模式的，尽管前者的技术数据吞吐量有限，并且几乎不提供关于整体网络的信息，而后者的分辨率不足以研究这些神经过程背后的单细胞尺度机制。

即使是多电极阵列，通常在网格模式中有数百个微米大小的电极，也具有较差的空间分辨率和有限的空间吞吐量，光学显微镜具有足够的空间分辨率和视场，可以观察到单细胞和网络级别的活动。

光学成像和神经生理学的大多数研究都集中在为功能性荧光显微镜工程外源性对比剂方面，常见的荧光标记物包括对钙离子通道的激活做出响应的Ca2+指示剂，电压或电流敏感染料，以及突触囊泡的标记物。

除了用于体外成像的外源性试剂外，还设计了几种转基因动物模型来表达神经生理学的荧光标记物，然而，荧光显微镜本质上需要相对较长的每像素曝光时间，这使得在生物安全光束功率下观察毫秒级动态变得具有挑战性。

已经做出了一些努力，以提高用于神经成像的荧光显微镜的时空吞吐量，如多光子激发，多个激发光束和光片成像，荧光成像技术的多样性受到限制，因为它们需要对样品进行修改，对比剂对局部生物化学的改变可能还会改变神经微环境中细胞的功能。

光片成像需要透明样品，并且以千赫兹帧速率进行快速荧光成像仅限于横向轴的FOV，其跨度仅为几十微米，无标记光学显微镜具有在必要的时空尺度上成像神经元和神经微环境的功能状态的多样性。

一种常见的用于无标记成像神经活动的技术是光学相干断层扫描和光学相干显微镜用于神经成像，作为神经科学中血液动力学光学成像的自然延伸，功能性OCT和OCT血管造影已被用于间接推断神经活动，血流是神经活动的间接且较慢的测量。

由于离子流引起的局部折射率和双折射的变化对快速神经活动更敏感，可以使用低相干干涉法从单个像素测量单个动作电位，可以通过对大角度散射的光进行分析或通过明场显微镜中的膜位移的差分检测来辨别单个动作电位。

甚至可以通过相敏感干涉法跟踪长期细胞电位的变化，除了折射率的变化，局部双折射的变化也会报告神经活动，在轴突重新定向导致膜电位变化时，双折射的变化大于背向散射光的变化，有时可高达一个数量级。

这些技术大多限于成像非常有限的FOV或成像较慢的动态，全场干涉法、定量相位成像和数字全息显微镜也已用于平衡测量散射光场的时空范围，特别关注提高相位稳定性并利用高速相机。

术语“神经活动”被用来表示神经微环境的集体活动，而“神经元活动”则指涉及个体神经元的子集的神经活动，而不是集体活动，

与仅对细胞的电活动敏感的传统电生理学不同，无标记光学显微镜响应对细胞的所有活动都敏感，其中电活动只是其中的一部分，使用无标记光学显微镜提取神经元的电活动需要通过传统电生理学测量和细胞电流的生化调节进行验证。

提出了一种多模态无标记光学显微镜，以在必要的时空尺度上成像这些神经活动的内在生物标志物，设计了一种超快速极化敏感离轴全场OCM，它使用每秒4,000帧的相机在两种不同极化状态下成像来自神经细胞培养物和参考镜之间的散射场的空间干涉。

双调制臂有效地利用了设置的空间带宽，尽管已经有几项研究将OCM强度的变化与测量相位相关联，并使用SPoOF OCM通过跟踪散射剖面通过强度的变化、通过相位的折射率以及通过极化敏感测量的双折射来成像整个FOV的单细胞尺度神经活动。

与以前的神经成像的相位敏感广域显微技术相比，SPoOF OCM的视场比两倍大，还测量了极化敏感的响应和结构成像，证明了SPoOF OCM用于成像分化的小鼠神经外胚层干细胞的自发活动以及神经电刺激的反应。

使用SPoOF OCM测量的哺乳动物神经元在2D表面培养中的折射率和双折射的变化被合并成单一的累积相响应度量，然后与电生理学测量进行比较，通过交叉相关分析这些测量的光学响应，以辨别整体瞬时相关矩阵。

使用SPoOF OCM测量的光学响应经过抑制其电活动使用四氢吡啶处理以验证其源自快速离子通道上的电流流动，神经活动的动态在毫秒时间尺度和微米空间尺度上可视化。

SPoOF OCM在千赫兹帧速率下建立了用于超并行无标记神经活动成像的光学显微镜，并为从侵入性和低吞吐电生理学转向无标记高吞吐的光生理学提供了一个框架。

• SPoOF OCM技术揭示神经细胞电刺激响应的复杂时空特征

使用SPoOF OCM进行测量，虽然样品中有几个稀疏分布的神经元，以突显SPoOF OCM对神经元细胞体、轴突和树突的高分辨率结构成像能力，但随后呈现的所有样品都包含了更密集的细胞群，以实现有效的电刺激和更容易地从多个细胞中同时进行场电位测量。

选择了靠近细胞结构中心的几个感兴趣区域，根据簇和其与电极尖端的接近程度，对ROIs进行了排序，电极尖端在ROIs 1至5附近明显可见，FOV中两个大簇之间的轴突连接在ROIs 11、13和48附近明显可见， SPoOF OCM的多个测量可以用于检测神经活动。

基于光学装置的Jones矩阵，可以描述检测到的OCM信号EP1和EP2，这种极化敏感的响应，在电极传递的电刺激瞬间之前，即在805 ms之前，大多数ROIs都是非活跃的，此后各个区域显示出明显的波动。

第二个刺激在1550 ms时施加，在两次刺激之后，都可以看到相位角度的波动，然而，这些波动似乎不像神经响应中预期的尖峰活动，这可以归因于相对于相位稳定性的较低强度稳定性，光源的偏振噪声以及在估计反正切时计算分数元素。

与先前实施的方法类似，可以根据方程计算两个响应之间的相关系数和滞后/提前时间，其中Sn是兴趣区域n的信号，Cmn是Sm和Sn之间的交叉相关，rmn是归一化的相关系数，τlagmn是区域n与m之间的滞后或提前。

以矩阵格式呈现，并伴随着描绘响应相关矩阵，其中Sm和Sn对应于δs，响应相关矩阵以前被用于描述神经网络中的连接模式。

跟踪相关矩阵突出显示，神经元的电刺激不仅会激活局部区域，还会激活整个网络，增加的相关性在800和1100 ms之间以及1500和1700 ms之间突然产生的连接所示，

在1100和1400 ms之间，持续的神经活动逐渐减弱，最终在1400和1500 ms之间恢复，刺激后立即，所有的响应似乎都具有可忽略的滞后和提前时间，但持续的神经活动模式，特别是在1000和1200 ms之间，显示出与神经电路的自然节律相对应的增加的滞后和提前时间。

• SPoOF OCM技术揭示神经元电活动的光学与电学关联

电刺激引发了神经元明显且较大的响应，可靠的神经生理学设置的目标必须是检测神经元的自发和刺激活动，并将这些光学测量与其电活动相关联，利用了一种能够进行场电位测量的电生理学设置，将光学响应与神经元的电活动进行比较。

根据它们与电极尖端的接近程度进行了排序，可以通过视觉识别单个细胞，尤其是在相位包装最小的神经结构边缘处，可以明显地识别出细胞，并且树突的连接是明显的，估计双折射角的响应，由于估计数量的灵敏度较低，因此似乎较弱。

从视觉上可以跟踪几个明显的响应，特别是在黑色和灰色箭头指示的特征中，这些响应的相关性通过使用方程进行了量化，并计算了在100 ms窗口内的响应相关矩阵，在这些矩阵中可以识别出一些活动中心。

相关矩阵的完整系列显示，通过电极测量显示，神经元的自发活动与电学测量进行了比较，在1300和1400 ms之间观察到的明显膜去极化情况。

在几个ROIs中可以观察到相位响应的尖峰，由于电学测量是场电位记录，电极最近的25个ROIs的响应相加，以进行视觉比较，虽然电极记录仅提供了对神经活动的狭窄视角，但光学响应为神经元的电活动提供了空间背景。

将光学变化转化为膜电位的第一步将涉及开发方法来归一化和累积个别像素级变化，放置在细胞附近的电极存在纳米级振动，这是由于安装中的微小不稳定性导致的。

直接与电极接触的细胞相对于远离电极的细胞具有更大的相位噪声，将来将使用场电位测量从较大的区域中收集来自样本的神经活动，这些区域受到电极运动的影响较小，并将紧邻电极尖端的ROI的累积响应与光学响应进行比较。

另一种方法是在多电极阵列上培养细胞来克服这个问题，SPoOF OCM测量光的传播方向上的光路长度或双折射的变化，离子通道沿细胞结构的方向排列可能会极大地影响SPoOF OCM的测量。

总结

由于离子流的空间分隔可能限制将像素级变化转化为累积细胞活动的能力，将来的研究将集中在尝试逐个选择性地阻断不同电压依赖性离子通道来孤立不同通道的响应。

每个通道的光学特性可以分别进行概要配置和累积，将光学响应转化为电生理测量，最近的研究已经精确校准了在光敏感神经元上的入射光功率与诱发的动作电位数量之间的关系。

类似的实验策略可以用于在没有降低测量相位稳定性的电极的情况下观察由光学触发的个别动作电位的光学响应特征，最后，尽管SPoOF OCM的目标是改善传统电生理学技术的吞吐量，但数据集过于庞大，一次性处理和可视化所有数据是不现实的。

为了突显SPoOF OCM的实用性，本文中展示的结果是针对几个ROI进行的，虽然图像重建是在图形处理单元上执行的，但将来的研究将利用完整的空时吞吐量，通过在GPU上进行超并行处理，完全从超并行采集配合超并行处理。

SPoOF OCM可以在毫秒时间尺度上实现无标记的全场成像，并以微米空间尺度在数秒内和数百微米内跟踪与神经活动相关的相位敏感和极化敏感变化，相信SPoOF OCM为从电生理学技术过渡到下一代光学生理学技术提供了一种多模式设置。

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