鲁凤民教授：全生物外泌体介导的靶向HBV DNA的基因编辑技术，为实现乙肝功能性治愈带来希望！
原文如上
HBV感染是人类健康的重大挑战，在中国有超过8000万慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）患者[1-2]，其中超过3000万患者需要被立即治疗，在这3000多万人中，仅仅有17%的人正在接受治疗，这和WHO的目标相距甚远[3]。目前CHB的治疗方式均非直接靶向乙肝病毒的遗传基因组，即 cccDNA（covalently closed circle DNA）和整合HBV DNA（Integrated HBV DNA） ，这也是导致CHB无法完全治愈的主要原因[4]。
CRISPR/Cas9是一种强大的基因编辑工具，其可以实现靶位点基因的删除或插入从而破坏特定的基因组。那么是否可以应用CRISPR/Cas9破坏cccDNA，删除整合HBV DNA呢？ 北京大学鲁凤民教授 在第二届肝病创新论坛上 介绍了其实验室以全生物外泌体为载体递送基因编辑系统CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9），通过基因编辑技术破坏HBV DNA的最新进展。
cccDNA是一种超级环状DNA，在感染的细胞中由HBV基因组松弛环状部分双链DNA （rcDNA）转换而来，是HBV复制的来源库，是慢性病毒持续感染和慢性乙肝难以治愈的主要病毒学因素。
整合HBV DNA可以表达HBsAg，而血清学HBsAg水平是CHB治愈的关键标志物，尤其是在乙肝病毒e抗原（HBeAg）阴性阶段，整合HBV DNA更是HBsAg的主要来源。所以整合HBV DNA的存在是另一个不能完全治愈CHB的原因，也是CHB患者发展为肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）的主要原因。
一、CRISPR/Cas9在HBV中的研究进展
1、单一gRNA的研究
2014年第一篇利用CRISPR/Cas9 靶向cccDNA的研究被报道[5]，早期研究仅设计了单个gRNA来引导Cas9蛋白剪切HBV cccDNA，断裂的DNA往往会立即被DNA损伤修复系统重新连接。由此以来，当设计靶向pre-C/C区域的gRNA，e抗原的表达将会被破坏；当设计靶向S和P区域时的gRNA，由于它们的开发阅读框是重叠的，S蛋白和P蛋白的表达将会被破坏。但是，仅通过单一的gRNA，仅会有一个病毒蛋白的表达被破坏，重新环化后的其他病毒基因可以继续进行转录、表达和分泌（图1[6]）。因此，单一gRNA 介导的基因编辑可能不会有效地破坏cccDNA。例如，靶向pre S/S区域，HBsAg的分泌急速下降，但是HBeAg却仍然维持在一个较高的水平，当靶向pre C/C区域时，也会发生类似的现象。
图1. 位于乙型肝炎病毒基因组中的gRNA靶向序列的说明
2、双gRNA的研究
如果将两种不同的gRNA递送进入细胞，那么每一种gRNA将会各自引导Cas9蛋白结合并在不同位点剪切cccDNA。假如这种剪切同时发生，两个剪切位点中间的片段将会被删除，剩余的cccDNA即便是被重新连接在一起形成更小的环状DNA，但由于部分基因被删除，这个小环状DNA不再能支持HBV DNA的复制（图2）。利用这一点设计一段覆盖两个剪切位点的PCR扩增引物，如果中间的片段没有被删除，那么较长的基因片段将会被扩增，如果中间的片段被删除，那么剩余的小片段会被扩增，然后应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以确定cccDNA是否被破坏。
图2. 双gRNA将cccDNA剪切后连接在一起形成更小的环状DNA
Wangjie[6]等设计了不同的gRNA并尝试不同的双gRNA组合，数据显示当应用双gRNA时， HBeAg和HBsAg浓度水平均同时大幅下降，双gRNA表现优于单一gRNA。在所有组合中，gRNA5+gRNA12表现尤其突出，扩增产物中几乎没有检测到全基因片段，意味着两个剪切位点之间的片段已经被删除，也意味着几乎所有的cccDNA都被破坏了（图3）。
图3. 双gRNA剪切后的基因片段检测结果
3、gRNA-miRNA-gRNA三联体的研究
为了更好地清除cccDNA，Wangjie（王杰）等将人工设计的靶向cccDNA转录本序列的miRNA放在上述两个gRNA中间形成三联体[7]。在表达Cas9蛋白的同时，转录非成熟的gRNAa-miRNA-HBV-gRNAb，接着利用细胞内源的Drosha和DGCR8释放pre-miR-HBV和gRNA，然后pre-miRNA进入细胞质形成成熟的HBV特异性miRNA，阻滞HBV的转录和翻译。同时，被释放的 gRNA与cas9蛋白结合并破坏有同样靶序列的cccDNA或者整合HBV DNA（图4）。
图4. gRNA-miRNA-gRNA三联体作用机制示意图
三联体应用的相关动物实验展示出令人兴奋的结果，研究使用小鼠模型，通过尾静脉注射三联体，对小鼠血清中的HBsAg进行定量检测，结果显示3-H38-12组表现突出，第7天的时候几乎检测不到HBsAg，肝组织切片中几乎没有发现HBcAg蛋白，这表明cccDNA已经完全被破坏掉，CRISPR/Cas9可以有效破坏HBV DNA（图5）。
图5. 小鼠血清及组织中HBsAg/HBcAg检测结果
二、递送系统-外泌体
对于体内基因编辑治疗来说，递送非常重要，外泌体是众所周知的递送系统，可以将DNA、RNA或蛋白从一个细胞递送到另外一个细胞，发挥着介导细胞间通讯的重要功能。那么，当CRISPR/Cas9基因编辑系统被递送进宿主细胞后，所分泌出来的外泌体中是否含有Cas9蛋白和gRNA，并将其递送到周围其他细胞中？
Chen ran（陈然）等[8]将CRISPR/Cas9和以HBV为靶点的gRNA共同转染进可支持HBV复制的HepAD38细胞，一组不加GW4869，另一组加入GW4869进行处理，并定量检测上清中的HBsAg。结果发现，即使转染效率只有10%左右，也可以抑制高达30%的HBV复制，但是在外泌体*制剂抑**GW4869的处理下，CRISPR/Cas9抑制HBV复制的强大能力明显减弱，这表明内源性外泌体一定程度上参与外周细胞内的基因编辑。
为了进一步证实外泌体可以将编辑工具运载到周围细胞中，首先需要确认外泌体中是否含有完整的gRNA和Cas9。
Chen等将HPV特异CRISPR/Cas9质粒和HBV特异CRISPR/Cas9质粒分别转染进Hela和HuH7细胞，对其分泌的外泌体进行理化表征，并通过RT-PCR和WB分别检测Hela和HuH7外泌体中gRNA和Cas9蛋白水平，结果证实两种细胞的外泌体中均存在完整的gRNA和Cas9蛋白（图6）。
图6. Hela和HuH7外泌体表征及gRNA和Cas9蛋白水平结果
将Cas-GFP融合蛋白质粒进行细胞转染，对HeLa和HuH7细胞分别进行免疫荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜下观察到Cas 9-GFP和外泌体标志物CD63蛋白存在共定位现象，进一步表明了Cas9蛋白可以进入外泌体中（图7）。
图7. 共聚焦显微镜Cas9-GFP和CD63蛋白定位图
载有活性物质的外泌体是否可以将其递送进入外周细胞内呢？
将纯化的载有Cas9蛋白的外泌体添加到加或不加蛋白翻译*制剂抑**CHX处理的HuH7细胞培养上清中。在添加后12和24小时，共聚焦显微镜下观察Cas9-GFP的定位。结果显示，加CHX组Cas9-GFP的表达没有明显降低，转染后12 h外泌体可以运载Cas9-GFP蛋白进入外周细胞细胞质中，转染后24 h可进入细胞核中，这对CRISPR/Cas9 发挥其基因编辑作用非常重要（图8）。
将含有Cas9和两种HBV特异性gRNA的外泌体纯化，加入到1.2×HBV质粒转染后的HuH7细胞中培养48 h，提取基因组DNA，PCR扩增结果显示PCR产物含有两个gRNAs编辑位点之间的序列被移除的HBV DN*片A**段，这说明外泌体运载的CRISPR/Cas9基因编辑系统可进入外周细胞并发挥活性作用破坏细胞中的HBV DNA（图8）。
图8.共聚焦显微镜下观察Cas9-GFP蛋白定位图/外泌体递送的基因编辑活性检测
为了进一步证明携带gRNA和Cas9蛋白的内源性外泌体可以将CRISPR/Cas9系统的基因编辑活性传递给周围细胞 ，将共转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的HuH7细胞作为供体细胞，1.2×HBV表达质粒转染的HuH7细胞作为受体细胞，转染后48小时，供体细胞和受体细胞在同一培养皿*共中**培养。共培养48小时后，从两个细胞中提取总DNA，基于PCR的克隆测序分析显示，PCR扩增后出现的小片段是两个gRNAs编辑位点之间的序列被移除的HBV DNA，进一步证明外泌体转运的CRISPR/Cas9可以进入外周细胞并发挥基因编辑作用。采用Hela细胞和HPV特异性的gRNA重复了同样的实验，也得到了相同的结果。
图9.实验操作示意图/外泌体递送的Cas9和gRNA的基因编辑活性检测
除上述两种细胞外，他们同时也探索了生物工程细胞在生产携带功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌体方面的潜在应用，结果显示两种工程细胞Vero和CHO外泌体也可以运载CRISPR/Cas9进入靶细胞的细胞核进一步破坏细胞的HBV DNA，这为内源性外泌体可能被用作传递CRISPR/Cas9系统基因编辑活性的载体提供了更高的可能性。 如果CRISPR/Cas9基因编辑系统和外泌体递送系统发展到临床应用，乙肝功能性治愈未来可期！
参考文献：
[1] World Health Organzation. Global Hepatitis Report 2017.Geneva:WHO.2017.
[2] GBD 2019 Hepatitis B Collaborators. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2022.
[3] Mehlika Toy, David Hutton , Jidong Jia , Samuel So. Costs and health impact of delayed implementation of a national hepatitis B treatment program in China. J Glob Health. 2022 Jul 8.
[4] Fabien Zoulim, Fanny Lebosse, Massimo Levrero. Current treatments for chronic hepatitis B virus infections. Current Opinion in Virology 2016, 18:109–116.
[5] Su-Ru Lin, Hung-Chih Yang, Yi-Ting Kuo. The CRISPR/Cas9 System Facilitates Clearance of the Intrahepatic HBV Templates In Vivo. Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Aug 19;3(8):e186.
[6] Jie Wang, Zhong-Wei Xu, Shuang Liu. Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9554-9565.
[7] Jie Wang, Ran Chen, Ruiyang Zhang. The gRNA-miRNA-gRNA ternary cassette combining CRISPR/Cas9 with RNAi approach strongly inhibits hepatitis B virus replication. Theranostics 2017, Vol. 7, Issue 12.
[8] Ran Chen, Hongxin Huang, Hui Liu. Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein. Small 2019, 15, 1902686.
专家简介
鲁凤民
北京大学基础医学院病原生物学系及北京大学感染病中心主任、北京大学肝病研究所教授。
研究方向为乙型肝炎病毒及相关肝病、肝癌的发病机制和诊断标志物的研发。实验证实HBV RNA病毒样颗粒的存在，推进了血清HBV RNA的临床应用；明确了血清GP73是不同病因慢性肝病肝硬化的可靠诊断指标；提出肝脏弹性指数测定（LSM）是反映肝脏炎症活动度的评价指标，进一步拓展了LSM在慢性肝脏疾病评估中的应用。作为课题负责人先后承担了国家“传染病防治”科技重大专项、国家自然基金面上项目、北京市科委重大项目以及“863”、“973”计划项目等课题二十余项，作为第一完成人获得中华医学科技二等奖一项，作为完成人获得国家科技进步二等奖两项。在国内外期刊发表研究论文近二百篇，被引用近万次。获得授权发明专利18项。