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作者： 欧喜超，宋泽萱，赵冰，裴少君，滕冲，郑惠文，贺文从，郉睿达，王怡婷，王胜芬，夏辉，周杨，何萍，赵雁林
第一作者及单位： 欧喜超，中国疾控中心结核病预防控制中心；宋泽萱，中国疾控中心结核病预防控制中心；赵冰，中国疾控中心结核病预防控制中心
通信作者及单位： 赵雁林，中国疾控中心结核病预防控制中心
Diagnostic efficacy of an optimized nucleotide MALDI-TOF-MS assay for anti-tuberculosis drug resistance detection
Ou X，Song Z，Zhao B，Pei S，Teng C，Zheng H，He W，Xing R，Wang Y，Wang S， Xia H，Zhou Y，He P，Zhao Y.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2023 Nov 18. doi: 10.1007/s10096-023-04700-y.
PMID: 37980301
研究背景
结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染性疾病，在世界范围内构成重大健康威胁。2021年全球估算有1060万例罹患结核病，包括45万例耐多药或利福平耐药患者。耐药结核病患者需要更长时间和更昂贵的治疗方案，治愈率较低且发生药物毒副作用风险更高。因此，快速准确地诊断耐药结核病（DR-TB）对于指导临床治疗和早日实现终结结核病流行的目标至关重要。
耐药结核病实验室诊断主要依靠传统表型药敏试验（DST）、快速分子生物学检测和基因测序技术。表型DST检测周期长且需要严格的生物安全防护措施。随着对MTB分子耐药机制的不断了解，耐药结核病分子检测越来越受到关注。目前WHO推荐耐药结核病分子检测技术/平台主要包括 Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF Ultra、TruenaMTB/RIF 、Abbott RealTime MTB RIF/INH、BD MAX MDR-TB、Cobas MTB RIF/INH和FluoroType MTBDR。但是上述检测技术/平台仅能检测有限数量的耐药突变位点，且对异质性耐药检测灵敏度较低。全基因组测序(WGS)可实现耐药突变位点检测全覆盖，但也存在一定的局限性，如检测成本高、仪器设备昂贵、需要专业人员进行测试数据分析和结果解读等。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)已被用于分枝杆菌鉴定和耐药性检测，该方法具有检测周期短、工作流程简单、成本低等优点。新型MALDI-TOF核酸质谱检测技术（浙江迪谱诊断技术有限公司，杭州）采用聚合酶链反应引物和单碱基延伸引物序列检测MTB目标耐药基因突变位点，用于预测 6 种常用抗结核药物的耐药性。本研究通过与表型 DST 和WGS 检测结果比较，评价新型MALDI-TOF核酸质谱检测用于抗结核药物耐药性预测的检测效能。
材料与方法
1. 样本选取与培养：从国家结核病参比实验室耐药监测菌株库随机选取263 株结核菌临床分离株，在罗氏培养基上传代复苏。
2. 表型微孔板法药敏试验：表型DST采用微量肉汤稀释法进行，该方法提供最小抑制浓度(MIC; Sensititre®UKMYC6 plate)，可测试13种抗结核药物的耐药性，包括异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和莫西沙星(Mfx)。根据 WHO耐药突变目录推荐的临界浓度，INH、RFP、EMB 和Mfx 的耐药临界点分别为 0.1、0.5、4 和 1μg/ml。EMB MIC为4 μg/ml时定义为不确定结果。
3. MALDI-TOF-MS检测：采用 DP-TOF 平台检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点。MALDI- TOF-MS检测主要步骤如图1所示，6种抗结核药物及其对应检测的耐药突变位点列于表 1。
4.全基因组测序(WGS)：利用Illumina HiSeq 2000平台对CTAB法提取的结核分枝杆菌基因组DNA进行WGS。采用世卫推荐Clockwork分析流程对所有原始测序数据进行分析，检测到Group 1（与耐药相关）和Group 2（暂时与耐药相关）耐药相关突变的菌株被定义为基因型耐药，未检测到相关基因突变的菌株被定义为基因型敏感。
5.统计分析：以表型DST和WGS为参考标准，分析MALDI- TOF-MS对RFP、INH、EMB和Mfx 耐药检测的灵敏度和特异度。以WGS为参考标准，分析MALDI- TOF-MS对链霉素(Sm)和吡嗪酰胺(PZA)进行耐药检测的性能。使用 kappa 值对两种检验结果的一致性进行比较。
研究结果
一、结核分枝杆菌分离株谱系构成和耐药特征
在263株结核分枝杆菌中，63.1% (166/263)、8.4% (22/263)和 28.5% (75/263)的菌株被划分为谱系2 (东亚型)、谱系3 (印度和东非型)和谱系4 (欧美型) (图2)。表型DST结果显示，INH、RFP、Mfx 和 EMB 耐药株分别占63.5% (167/263) 、41.8% (110/263) 、20.5% (54/263) 和12.9% (34/263)。28株菌乙胺丁醇（EMB）耐药检测为不确定结果 (图 2)。对 6 种抗结核药物进行基因型耐药分析。INH、RFP、EMB、Mfx、Sm和PZA耐药率分别为57.0% (150/263)、43.0% (113/263)、20.5% (54/263)、19.8% (52/263)、38.8% (102/263)和8.4% (22/263)。
二、与表型DST比较，MALDI-TOF-MS检测效能分析
利用表型DST作为参考标准，MALDI-TOF-MS可准确预测MTB 对4种抗结核药物的耐药性(表2)。在110个表型RFP耐药菌株中，2株菌MALDI-TOF-MS 检测为敏感。WGS结果表明，2株菌株携带 rpoB_1335_del_3_CAAG_C和rpoB_1296_ins_3_A_ATTC，两种突变在MALDI-TOF-MS检测范围之外。2株表型RFP敏感株被MALDI-TOF-MS鉴定为耐药，2株菌携带临界浓度 rpoB 耐药基因突变，分别为rpoB_L430P和rpoB_H445N。
12株菌经MALDI-TOF-MS检测为INH敏感但表型耐药，经WGS鉴定，10株菌株无已知耐药突变，其余2株菌katG中分别携带 c.1328_1329insA和c.143_146dupTGCA。1株菌经MALDI-TOF-MS 鉴定为INH耐药但表型敏感，WGS分析表明，该菌株存在fabG1_c.-15C > T突变。此外，6株EMB表型耐药株经MALDI-TOF-MS检测为EMB敏感，其中4株菌不携带突变(由WGS确定)，2株菌株携带 embB_G406A和embB_Y319S 突变，列在WHO突变目录第1组（MS漏检）。4株EMB表型敏感株MALDI-TOF-MS鉴定为耐药，3株菌存在基因突变（M306V; G406D, Q497R）。此外，4株MALDI-TOF-MS分析显示MXF敏感但表型耐药，其中仅1株菌存在 gyrA_D94Y突变，其余3株均未检测到已知的耐药突变。1株携带gyrA_ D94N突变的菌株经MALDI-TOF-MS鉴定为耐药，但表型DST结果为敏感。
三、与WGS比较，MALDI-TOF-MS检测效能分析
与WGS 结果相比，MALDI-TOF-MS法检测RFP耐药的灵敏度、特异度和 kappa 值分别为97.4%、100.0%和0.98; INH为98.7%、92.9%和0.92; EMB为96.3%、100.0%和0.98; MXF为98.1%、100.0%和0.99; Sm为98.0%、100.0%、0.98(表3)。除PZA外，MALDI-TOF-MS检测结果与WGS检测结果高度一致。在WGS 鉴定的所有RFP耐药菌株中，3株菌MALDI-TOF-MS 检测为敏感，2株菌rpoB均携带indel突变体(rpoB_1335_del_3_CAAG_C和rpoB_1296_ins_3_A_ATTC)，另一株为rpoB_S441L，这3种突变形式均不在MALDI-TOF-MS检测范围。利用 WGS 鉴定出的2株INH耐药株因 katG 中存在c.1328_1329insA 和 c.143_146dupTGCA 突变 (不在MALDI- TOF-MS检测范围内)而被MS鉴定为敏感。使用MALDI-TOF-MS检测到8株具有 ahpC 基因突变(C-52 T, C-81T)的表型耐药菌株，不包括在世界卫生组织突变目录第1组和第2组。在MXF基因型耐药菌株中，只有1株携带 gyrA_D94Y的耐药株被MS漏检。2株Sm耐药菌株携带的突变体(gid_Arg39fs; rpsL_K43R)不包含在MS 检测范围内，导致MS和WGS检测结果不一致。在PZA基因型耐药菌株中，有11株经MALDI-TOF-MS 检测为敏感，其中1株携带pncA_F94L突变，其余10株菌的突变位点不在MALDI-TOF-MS检测范围内。
四、MALDI-TOF-MS方法对异质性耐药的检出能力
MALDI-TOF-MS能够识别异质性耐药，MALDI-TOF-MS发现7株菌表现出异质性耐药，如图3所示，在菌株NTRL0051中，rpoB526的WT_CAC高度为13.67, TAC高度为3.96, TAC/CAC比值为 29%（图3A）。通过Sanger 测序证实了这一结果，结果显示C峰高，T峰短(图3B)。在菌株NTRL0104中，rpoB531的WT_TCG高为13.67，TTG 高度为8.12，TTG/TCG比值为31%（图3C），通过Sanger测序得到证实(图3D)。在菌株 NTRL0008中，gyrA94对WT_GAC的高度为3.76，对GGC的高度为5.41，对GCC的高度为3.64，其GGC/GAC比值为144%，GCC/GAC比值为97%（图3E），也通过Sanger测序得到证实(图3F)。
研究结论
MALDI-TOF-MS对于抗结核药物耐药性检测具有非常好的检测效能，在开放式的MALDI-TOF-MS检测平台上，通过加入更多优化设计的引物，可以方便地将新的耐药突变位点添加到多重检测体系中。与其他方法相比，核酸质谱技术具有检测成本低、检测通量高、可检测异质性耐药等优点，因此，核酸质谱技术在耐药结核病早期诊断领域具有较高的应用价值。