引言
红球菌属、戈登氏菌属、微杆菌属和节杆菌属等四个代表性放线菌属分解3-氯苯甲酸酯 (3CBA) 的能力，对4-氯儿茶酚的形成是3CBA分解过程中唯一的关键中间体，但混浊红球菌菌株1CP是一个例外，其细胞通过 3-氯和 4-氯儿茶酚分解 3CBA。
本文的目的是确定在革兰氏阳性菌分解 3-氯苯甲酸酯期间诱导的氯儿茶酚双加氧酶的类型， 利用假设红球菌对 3CBA 和3CP的进一步转化仅形成4CCat，猜测混浊红球菌1CP 菌株对 3CBA 的降解是在新修饰的邻位途径酶的作用下进行的。
一、氯化取代基：假单胞菌与产碱菌属sp菌株
在存在3CBA的情况下，在这些细菌的生长过程中诱导的酶 3-氯苯甲酸 1,2-双加氧酶 (3CBDO) 在底物特异性方面与在存在苯甲酸盐的情况下生长时诱导的苯甲酸双加氧酶有明显差异。
opacus 6a菌株被发现含有编码氯儿茶酚1,2-双加氧酶、氯粘康酸环异构酶和二内酯水解酶的基因，其核苷酸序列与编码修饰的4-氯儿茶酚邻酶的相应基因序列100%一致， -菌株R. opacus 1CP 的切割途径。
编码氯粘康酸内酯脱卤素酶的基因（clcF ) 未在放线菌属的代表中发现，包括Gordonia和Arthrobacter，携带 3-氯儿茶酚降解基因的线性巨型质粒在将R. opacus 1CP 菌株在富含琼脂的培养基上维持 25 年后保持稳定。
此类酶的底物特异性与所研究菌株的类似酶的特异性有明显差异，介导未取代的苯甲酸酯分解并形成儿茶酚作为关键中间体，当使用氯儿茶酚时，需要具有新底物特异性的酶，才能成功转化单氯代和二氯代芳香族化合物。
化合物3CBA在工业上还用作制造染料、药物制剂和杀菌剂的原料，以及粘合剂和染料的防腐剂，由于多氯联苯和氯甲苯的共同代谢以及水的氯化作用，该化合物会在环境中积累，在工业废水、河流和地下水中检测到 3CBA。
化合物 3CBA 是许多研究人员用作“模型”的化合物之一，用于研究微生物分解氯代芳烃化合物的能力，并确定参与该过程的酶的特征。
相对较短的时间内，该领域就取得了重大进展，不同类群的细菌对 3CBA 和许多其他单芳烃化合物的初始转化反应仍然缺乏研究。
如果在第一阶段不发生脱卤，则 2-氯苯甲酸酯 (2CBA) 和 2-氯苯酚 (2CP) 或 4-氯苯甲酸酯和 4-氯苯酚 (4CP) 的分解，伴随着 3-氯儿茶酚 (3CCat) 或 4-氯儿茶酚 (4CCat)，3-氯苯酚 (3CP)、3-氯苯胺 (3CA) 和 3CBA 的转化仍然最不清楚，因为在这种情况下，可以形成 3CCat 和 4CCa， 所得产物的比例将取决于初始攻击酶的底物特异性 。
来自几种革兰氏阴性菌，假单胞菌属的苯甲酸双加氧酶的底物特异性，B13 和恶臭假单胞菌pAC 27 已被研究，3CCat 和 4CCat 的形成比例为 66:33，一些间位带取代基的单氯芳烃化合物在红球菌作用下的转化过程已经研究过了。
二、苯甲酸酯和苯酚取代放线菌的活性
诱导酶 3CBDO 由 3CBA 的降解启动，并在氧依赖性反应中催化， 这种酶具有复杂的结构，无法在无细胞提取物中测定其活性 ，当细菌细胞被破坏时，这种酶就会受损，通过测定在酶底物存在下细菌细胞耗氧率的变化来测定整个细胞中的酶活性。
如果该物质不是酶的底物，则细胞呼吸在该物质存在下不会发生变化，测定了放线菌细胞对苯甲酸盐、单取代和双取代苯甲酸盐、苯酚和单取代苯酚的反应， 细胞对底物的反应以对 3CBA6 的反应的百分比给出，对 3CBA 的反应被视为 100%。
opacus 1CP的 3CBDO不仅在取代的苯甲酸酯存在下而且在氯化苯酚存在下都具有活性 这是由于培养物基因装置的特殊性， 其中编码的酶介导了多种污染物的降解 ，基于R. opacus 1CP 放线菌的固定化细胞，使用生物传感器技术记录了诱导细胞对*酮丙**的反应。
对于由该底物诱导的放线菌细胞，观察到在存在*酮丙**的情况下显着激活呼吸作用，对于诱导*酮丙**代谢的酶系统，已发现底物的正动力学协同性，至于 1CP 细胞的 BDO，双相互依赖关系图的非线性证明了这一点。
菌株的无细胞提取物中，测定了参与氯代芳烃化合物分解的修饰邻位途径酶的活性，在 3-CBA 生长的R. opacus 1CP、R. ruber P25 和M. foliorum B51 菌株的无细胞提取物中，显示了 CCat 1、2-DO 和 DLH 活性。最不明显的画面是 CMCI。
只有R.opacus菌株1CP 对粘康酸盐（0.003 µmol/min/mg 蛋白质）显示出低活性，仅在R.ruber P25菌株中发现了 2-甲基粘康酸盐的活性，除M. foliorum外，所有菌株均检测到 3-甲基粘康酸盐的活性B51，同时观察到R. opacus 6a、R. opacus 1CP 和R. ruber P25与 2-氯粘康酸盐的活性。
而对于 3CBA 生长的R. ruber P25 菌株，氯儿茶酚 1, 2-DO 与 3MCat 的相对活性（125%）略高于与 Cat 的相对活性，与 4MCat 的活性（162%）明显更高，当R. ruber P25 在对甲苯甲酸存在的情况下生长时，Cat 1,2-DO 与 3MCat (195%) 的活性高于 4MCat (117%) 。
对于由 3CBA 诱导的氯儿茶酚 1, 2-DO，4CCat 存在相对较高的活性表明，P25菌株可能具有多种底物特异性不同的双加氧酶，在氯儿茶酚 1、2-DO 的情况下，从 3CBA 生长的R.opacus中分离出来1CP菌株与3MCat和4MCat的相对活性分别为120和197。
而对于 2CP 生长的R. opacus 1CP，活性分别为 283 和 270 ，对于M. foliorum B51 菌株，与 3MCat 相比， 氯儿茶酚 1,2-DO 与 4MCat 的活性相当高 ，以在含有相同底物（在本例中为 3CBA）的培养基中生长的革兰氏阳性细菌中的氯儿茶酚 1,2-DO 为例，该研究表明，诱导的酶在底物特异性方面可能存在显着差异。
这些差异可能是由于具有不同特性的酶的诱导以及无细胞提取物中存在几种酶的 CCat 1,2-DO 亚型，为了找出某些双加氧酶异常特性的原因，我们试图确定每种酶的同种型数量，作为从 3CBA 生长的R. opacus 1CP 菌株的生物量中纯化酶的结果，在纯化的每个阶段都以单峰的形式检测到双加氧酶活性。
来自第二个峰的酶可归因于对 4CCat (77%) 具有相当高活性的氯儿茶酚双加氧酶，该酶对 3,5-DCCat (9.8%) 也有活性，就底物特异性而言， 该酶与 4CP 生长的R.opacus的类似酶密切相关1CP 。
纯化过程中双加氧酶底物特异性的变化表明 1CP 菌株中存在几种同工酶，此功能允许菌株适应新的生长基质，对于研究的 3CBA 生长的红球菌，检测到一个双加氧酶活性峰，相反，对于与任何氯化底物一起生长的R. opacus 1CP，仅诱导 CCat 1,2-DO，在含有未取代的苯甲酸酯和苯酚的介质上，仅诱导 Cat 1,2-DO。M. foliorum B51。
三、clcF 基因位于放线菌中
酶 5CMLD 使菌株R. opacus 1CP 能够使用 2-氯苯酚作为唯一的生长来源，通过新的改良邻位途径分解由 2-CP 形成的 3- CCat，clcF基因在R. opacus菌株 1CP 中的存在先前已显示，该基因是 10 多年前在用 4-CP 生长后适应 2-CP 的培养物中发现的。
一个有趣的事实是，该研究能够识别在实验室中在丰富培养基中储存超过 25 年的细胞中的基因，获得的数据与现有观点存在一些矛盾，即细菌降解污染物的能力，由生物降解质粒的存在介导，由于相应质粒的消除，在没有暴露于毒物的情况下迅速丧失。
这种情况下，已知R. opacus 1CP 菌株中新修饰邻位途径的基因位于线性质粒上，在非选择性条件下保留该途径的至少一个基因可能表明该菌株在富培养基上生长时稳定地保留了该质粒。
检查编码 CMLD 的基因在芳香分解菌株中的分布表明，在几种芳香分解菌株中发现了它的精确拷贝，Rhodococcus wratislaviensis种细菌，在发现该基因的基因组中，是从彼尔姆地区被卤代芳烃化合物污染的地点分离出来的，其特点是能够分解氯代联苯。
氯代联苯的分解途径并不意味着 3-CCat 作为关键中间体的形成，在这种情况下， 它间接证明了该基因的遗传也发生在没有选择压力的情况下 ，该研究没有证据表明在田间条件下（来自 OAO Halogen 地区的土壤）这些菌株是否没有选择压力。
四、MALDI-ToF质谱分析被采用
使用 CMLD 作为标准可以克服 MALDI-ToF MS 方法的一个重大缺点，所分析蛋白质的质量对该方法的使用施加了重大限制 ，除非预期用裂解剂对全细胞或蛋白质溶液进行任何预处理 ，MALDI 的使用通常仅限于该仪器可以记录的质量。
对在3-CBA 上生长的R. opacus 1CP 菌株的全细胞和从中分离出的 CMLD 的分析显示一个质量为 11,193 Da 的峰，这与 CMLD 的衍生质量非常吻合, 这表明在该培养物与 3-CBA 的生长过程中形成了 3-CCat 。
而R. ruber P25 和M. foliorum B51的部分纯化蛋白质制剂的分析也产生了相应的质量峰，通过 MALDI 光谱法分析以 3-CBA 作为唯一生长底物的琼脂矿物培养基上生长的 R. wratislaviensis G10、P20 菌株的全细胞未显示单电荷、双电荷或三电荷 ClcF 的任何峰特征离子，这很好并且与无细胞提取物中缺乏可见活性一致。
大多数红球菌的基因组很大，并且含有大量的生物降解基因，用甲苯分离的红球红球菌B7g的基因组包含 7,175,690 bp，大尺寸的放线菌基因组使它们能够编码足够数量的可生物降解酶。
327个红球菌属基因组的系统基因组学分析表明，红球菌属拥有一个由 381 个直向同源群 (OG) 组成的小型“硬”核心基因组，而 99.16% 的基因组达到了 1253 个 OG 的“软”核心基因组。
存在于编码降解酶的大量基因的红球菌基因组使得将红球菌视为生物技术中有前途的试剂成为可能， 经充分研究的约氏红球菌RHA1 菌株的基因组包含大量编码氧化酶的基因 ，这种遗传潜力使该菌株能够分解大量有机化合物。
红球红球菌菌株 MI2 能够降解芳香族和脂肪族化合物，包括异生有机二硫化物 4,4'-二硫代二丁酸，菌株R. erythropolis已发现 DCL14 能够代谢高浓度的烷烃、萜烯、醇和芳香族化合物作为唯一的碳源和能源 ，这种基因多样性使这种细菌对生物修复过程具有吸引力。
总结
本文表明了3CBA允许细胞适应可用的底物并将它们用作生长源，放线菌属于所谓的分散菌群，其特点是能够吸收低浓度的有机物质，放线菌的特征在于大量外周代谢酶， 这些酶则为细胞提供了降解反应的可变性。
土壤中存在各种种类的放线菌，其基因组中含有不同底物特异性的酶，通常允许该组细菌利用结构/特征和取代基数量不同的化合物，而丰富的生物降解酶使这些细菌在物质浓度大大降低的条件下生存。
上述特征使放线菌能够成功地与其他类群的细菌竞争可用底物，同时从环境中去除污染物。
参考文献
- 李文均,冯楚莹,曹理想,吕志堂,董雷，《“微生物学”教学内容须与时俱进：对放线菌的认知演变及研究进展》
- 崔熙雯,林小锐,李家兵,张虹,韩永和，《抗逆放线菌的多样性、功能特性及其在环境修复中的应用》
- 张兆娟,杨应昆,邹月,迪力达·叶尔肯别克,翟超,孙达,李萌,李玉,刘朴，《从不同地区网柄菌中分离和纯培养的共生放线菌》