近日，中国科学院深圳先进技术研究院赵晓丽团队与香港大学深圳医院黄德民团队，在工程化改造干细胞外泌体用于促进骨再生方面的研究取得进展。相应成果“Engineering Stem Cells to Produce Exosomes with Enhanced Bone Regeneration Effects: An Alternative Strategy for Gene Therapy（工程化干细胞产生具有增强骨再生效果的外泌体：基因治疗的另一种策略）”在Journal of nanobiotechnology （IF：10.435）上发表，深圳先进院博士生郝浏智为论文共同一作之一并做出主要贡献。

文献摘要

针对组织缺损和退行性疾病的治疗，干细胞治疗一直是组织再生领域研究和应用的焦点，但在临床应用仍然存在很多的问题。干细胞外泌体近年来被发现是干细胞旁分泌作用调控组织再生的重要介质。作为一种“无细胞”治疗技术，将有希望克服应用干细胞技术存在的一些问题，但其针对特定组织的治疗效果还有待进一步提高。

本研究结合基因递送技术，通过骨形态发生蛋白2（BMP2）基因对来源干细胞进行工程化改造，促进其分泌的外泌体具有更加显著的成骨作用。通过对干细胞进行基因工程改造的方法避免了直接改造外泌体带来的毒副作用，可以获得具有目的疗效和更强治疗效果的外泌体而应用于下一步的临床治疗中。该工作为利用外泌体促进骨再生的治疗提供了新的方法，同时也为通过基因工程改造外泌体治疗其他疾病提供了新的思路和策略。

实验流程

实验结果

图1

使用liposome将BMP2基因导入hMSCs（图1a）。质粒DNA（pGFP-BMP2）编码BMP2和绿色荧光蛋白（GFP）促进转染评估效率。hMSCs照明下的绿色荧光转染后显示成功表达质粒DNA的表达（图1b）。转染效率流式细胞仪定量显示为15.01%（图c）。转染后hMSCs中BMP2的mRNA表达显著上调，这表明BMP2基因在hMSCs中的表达。成骨相关基因，如矮子相关转录因子2（Runx2）、osterix（OSX）、碱性磷酸酯（ALP）、骨唾液蛋白（BSP）和骨桥蛋白（OPN）也被检测到增强（图1d）。相比之下，转染pGFP显示的结果与未经治疗的对照组相似。此外，表达的pGFP-BMP2转染组的蛋白水平也显著升高显著高于对照组和pGFP组分组。 结果表明:BMP2基因的传递启动了hMSCs的成骨分化。

图2

收集hMSCs分泌的外泌体（MSC-Exo）和BMP2基因工程hMSCs的外泌体（MSC-BMP2-Exo）（图2a）。透射电镜下，外泌体呈球形纳米颗粒图像和显示的直径大致相同150 nm，通过纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）测定（图2b，c）。MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo之间没有区别。Westernblot：两者MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo对膜标记物CD9和CD63以及与肿瘤相关的蛋白质呈阳性ESCRT非依赖性通路TSG101（图2d）。这些结果表明，从hMSCs中提取的纳米颗粒主要是外泌体。分析外泌体内核酸含量。有趣的是，与MSC-Exo相比，MSC-BMP2-Exo中骨质分化相关基因（包括BMP2，Runx2，OSX，ALP，BSP和OPN）的mRNA表达显着上调。这些也高于来自成骨诱导的hMSCs（MSC-OB-Exo）的外泌体（图2e）， 这表明外泌体的mRNA含量可通过工程其供体细胞来调节。

图3

安全性和治疗效果对于促进基于外泌体的治疗的应用至关重要。MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo可能被受体细胞MSC摄取。用3,3'-二十八碳氯卡氰高氯酸盐（Dio）进行荧光染色，可以在受体细胞的细胞质中发现绿色荧光的外泌体。通过流式细胞仪进一步量化细胞摄取。对于MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo，吞噬外泌体的受体细胞的百分比分别约为56.0%和64.2%（图3b，c）。 这些结果表明，MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo都具有出色的细胞摄取效率。MSC-BMP2-Exo的细胞摄取效率较高可能是因为工程化的MSC-BMP2-Exos增加了外泌体和hMSCs之间的结合和相互作用，使其更容易被靶细胞吸收。 作为治疗性基因递送载体，评估了外泌体的生物相容性。两个外泌体在孵育72 h后对hMSCs均无毒性作用（图3d）。与MSC-Exo组相比，MSC-BMP2-Exo组的细胞增殖略低，这可能与其不同的细胞摄取效率有关。然而，脂质体/ pBMP2质粒的复合物以推荐浓度与细胞一起孵育，导致细胞活力低于50%。 这一结果表明，即使介质细胞具有基因递送载体的固有毒性作用，但它们携带货物的外泌体也不会将这些效应转移到受体细胞上。

图4

研究外泌体的成骨促进作用。成骨诱导促进了成骨细胞谱系的承诺，相关基因表达（包括Runx2，OSX和ALP）在治疗5天后在OB组中观察到（图4a）细胞在正常培养基（对照组）、分化培养基（OB组）、添加MSC-Exo的分化培养基（MSC-Exo组）。在分化培养基中加入MSC-BMP2-Exo可以显著上调BMP2基因的表达。WB表明MSC-BMP2-Exo组在第7天OSX和Runx2的蛋白质水平显着增加（图4b）。ALP和茜素红染色实验进一步证实了MSC-BMP2- Exo对hMSCs的成骨有增强作用。（图4c）。茜素红染色和定量分析显示MSC-BMP2-Exo可以在第21天增加钙结节的形成（图4c，d）。 结果表明MSC-BMP2-Exo对调节受体hMSC细胞的成骨功能。

图5

MSC‑BMP2‑Exo通过BMP2/Smad途径促进小梁骨与皮质骨结合再生。MSC-BMP2-Exo通过小鼠股骨模型研究MSC-BMP2-Exo是否能加速骨愈合(图5a)。研究了6只股骨缺损小鼠分为三组，分别用0.9%生理盐水，MSC-Exo，MSC-BMP2-Exo（一周一次注射，共四周）通过显微计算机断层扫描对骨再生效果进行研究和分析（显微CT）（图5b、c）。 重建的股骨三维图像和结构参数表明MSC-BMP2-Exo增加了小梁骨量。与注射盐水或MSC-Exo的小鼠相比，MSC-BMP2-Exo组第15天的骨体积分数（BV / TV）和小梁骨数（Tb.Th）显着增加。

图6

BMP2/Smad通路的免疫组化分析。H&E染色证明MSC-BMP2-Exo组表现出更多的新骨形成（图6a）。与第15天相比，第30天的BV / TV减少表明缺损愈合后的骨重塑过程。BMP2下游标志物Smad1/5/8的免疫组织化学测定显示，在MSC-BMP2-Exo处理组的损伤部位周围第15天观察到许多Smad1/5/8阳性细胞（图6b）。 这一发现证明MSC-BMP2-Exo通过BMP2 / Smad信号通路改善了小梁骨再生。

图7

研究体内MSC-BMP2-Exo对皮质骨再生的影响。15只老鼠股骨中段骨缺损股骨分为三组。每组分别用0.9%生理盐水、MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo注射治疗（图7a）。微型计算机断层扫描（micro-CT）显示：每周局部注射MSC-BMP2-Exo可显著增强损伤部位皮质骨的再生（图7b）。 重建的股骨三维图像和结构参数表明MSC-BMP2-Exo增加了小梁骨量。 与对照组和MSC-Exo组相比，MSC-BMP2-Exo组在第15天显著促进了缺陷的愈合（图7c）。受伤部位BV/TV的结构参数和皮质厚度（Cr.Th）也显示出相应的趋势（图7d）。

图8

外泌体直接注射在骨骼损伤部位、尾静脉，在组织中外泌体的分布和再生效果的影响关系。裸鼠在股骨远端的右侧产生骨缺损，而左侧保持完整，随后在两侧局部注射Cy5.5标记的外泌体（图8a[i]）。通过荧光成像显示，无论是否存在骨缺损，MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo可以保留在注射部位超过48小时，（图8b、c）。然后切除股骨并成像，仍可观察到荧光强度(图8d，e)，表明外泌体在骨组织中被保留。在缺损组中，外泌体直接注射到骨髓中，观察到骨髓外泌体进入体循环中释放的荧光强度降低。骨组织对荧光的屏蔽也可能注入强度。 综上结果表明，在局部注射后，外泌体可保留在骨损伤部位数天，以充分发挥治疗功能。外泌体在骨髓中的保留可能与损伤组织的归巢效应有关。 因此，将右股骨骨缺损小鼠（缺损组）与无骨缺损小鼠（对照组）进行比较，并将Cy5.5-MSC-BMP2-Exo静脉注入尾静脉（图8a[ii]）。在注射48h后，研究了外泌体在不同器官中的分布。两组患者心、脾、肺、肾均少有残余荧光，肝脏均有强荧光。MSC-Exo和MSC-BMP2-Exo对肝细胞无细胞毒性。受伤的股骨显示荧光强度高于对照组（图8f，g），这可能表明受伤的骨骼吸引了MSC衍生的外泌体归巢。

图9

质粒DNA可以被供体细胞包装，并通过分泌的外泌体运输到受体细胞。MSC-BMP2-Exo的成骨促进作用在体内外均得到了证实。通过脂质体介导的BMP2基因传递产生的基因工程干细胞改变了分泌的外泌体的核酸含量。鉴于脂质体和外泌体都依赖于核内体介导的细胞运输，我们研究了转染后质粒DNA是否可以被包装成外泌体。因此，用红色荧光树脂POPO-3碘化物标记质粒DNA，研究了质粒DNA的迁移情况(图9a)。转染hMSC后，在hMSCs中观察到强烈的红色荧光，表明质粒DNA通过脂质体成功地传递到这些细胞中(图9b)。然后在转染后24和48小时收集MSC-BMP2-Exos。用醛/硫酸盐乳胶珠进行培养细胞术检测外泌体(MSC-PO-BMP2-Exo)中是否存在红色荧光，转染后24h和48h分别观察到3.87%和1.94%的荧光(图9c)。以无红色荧光的MSC-Exos作为对照。将POPO-3碘化物与MSC-Exo混合，然后纯化(PO-MSC-Exo)。纯化的混合物几乎没有显示荧光。有趣的是，使用溶酶体抑制氯喹依赖性降解显著使转染后24和48h外泌体中质粒DNA(CQ-MSC-PO-PO-BMP2-Exo)的数量分别增加到15.5%和5.64%(图9c，d)。最后，MSC-BMP2-Exos进一步用Dio染色，并与受体细胞孵育。外泌体在受体细胞中的内化表现为绿色荧光。有趣的是，共聚焦显微镜图像显示，在受体细胞中也可以观察到外泌体携带的质粒DNA黄色荧光(图9e)。 结果表明：在基因工程过程中，脂质体传递的质粒DNA可以被干细胞包装成分泌的外泌体。该方法可用于临床制备DNA/外泌体复合物。

文献思路

在本研究中，一种干细胞介导的基因治疗策略可以产生具有增强骨再生能力的外泌体(MSC-BMP2-Exo)。间充质干细胞通过骨形态发生蛋白-2基因进行基因工程，以改变分泌的外泌体的含量。增强骨再生效果是由于MSCs的含量与BMP2表达上调的协同作用。MSC-BMP2-Exos也具有生物相容性、对损伤部位的归巢能力和质粒DNA的传递。加速骨愈合作用和良好的生物相容性表明该思路具有临床应用潜力。