在阅读此文前，诚邀您请点点右上方的“关注”，既方便您进行讨论与分享，还能及时阅读最新内容，感谢您的支持。

欧文氏菌(Erwinia)是一种无芽孢、周生鞭毛，菌体形态多为杆状的革兰氏阴性菌，普遍存在于自然界中，在水环境和土壤中尤为常见。

欧文氏菌有抑制藻类生长和溶磷的特性。

欧文氏菌属的大多数菌种属于植物病原菌，常引起植物溃疡、叶斑、坏死、软腐等症状。

欧文氏菌属在植物感染中常见的病害类型为细菌性软腐病，该病广泛分布于全球各地，被侵害的植物类型多样，如药用植物、观赏性植物、果蔬等。

细菌性软腐病的病原菌主要包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)这3个亚种。

综合国内外的研究现状来看，欧文氏菌大多发现于受侵害的植物体内，未见发现于动物体内的相关报道。

有报道表明，欧文氏菌可引起人类化脓性关节炎，这例感染是由于棕榈树创伤导致，文章中所统计的人类感染病例大都源于植物侵害。

细菌鉴定有助于预防疾病和健康养殖。

笔者从鸡肠道菌群内分离出1株S21欧文氏菌，该菌在动物体内较为罕见，鸡群表现未见异常。

16S r DNA序列是目前通用的细菌分类和系统发育的遗传指标[8]。

本试验通过分子生物学等一系列鉴定方法，并建立遗传进化分析将其准确鉴定，后期对其进行耐药性和耐药基因的检测，以期为日后防控该类细菌感染引起的动物性疾病提供理论依据。

试验材料

实验动物

本试验所用沐川乌骨黑鸡均来自乐山市沐川县某养殖场。

主要试剂

普通营养琼脂、细菌生化鉴定管、抗生素药敏片等，均购自杭州微生物试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂等，均购自北京全式金生物技术有限公司。

主要仪器

光学显微镜，购自麦克奥迪公司；超净工作台和立式电热压力灭菌锅购自青岛海尔公司；恒温空气摇床和恒温培养箱购自上海龙跃实验仪器设备有限公司；离心机由Thermo公司生产；凝胶成像系统购自德国耶拿分析仪器股份公司；PCR仪和电泳仪购自美国SBP公司。

试验方法

细菌的分离与革兰氏染色

无菌提取肠道内容物并划线接种于普通固体培养基，在培养箱中37℃培养24 h，挑取可疑单个菌落进行纯培养后，观察菌落形态并进行革兰氏染色镜检。

疑似菌株经纯化后接种于琼脂斜面4℃保存，备用。

生化试验

将分离菌无菌接种于细菌微量生化管中，主要包括甘油复红试验，阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇等糖(醇)类发酵试验以及吲哚试验和脲酶试验等。

37℃培养24 h后，观察并记录结果。

药敏试验

采用国际通用的K-B纸片法对分离菌进行抗生素耐药性检测，参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，简称CLSI)标准进行试验结果的判断。

16S r DNA扩增及序列分析

挑取纯化的菌落接种于普通肉汤培养液中进行扩大培养，随后收集菌液进行离心，离心后使用细菌DNA提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA。

PCR扩增使用的通用引物由成都擎科生物有限公司合成，引物序列见表1。

以稀释后的DNA样品为PCR模板，使用擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系如下：1×TSE101金牌mix 45μL,27F(10bp)2μL,1492R(10 bp)2μL,DNA模板1μL。

反应条件：98℃预变性2 min;98℃10 s、56℃10 s、72℃15 s,35个循环；72℃延伸5 min；最后4℃保存。

取2μL PCR产物和6μL溴酚蓝进行琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA Marker作为参照。

电泳成功后，将胶体放入凝胶成像系统中进行观察，切下目的条带做胶回收试验。

胶回收参照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行操作，胶回收完成后将回收的目的条带送擎科生物有限公司测序。

表1 通用引物序列

16S r DNA系统进化树的构建

将分离菌的测序结果与NCBI数据库中的8种不同来源的欧文氏菌进行BLAST (basic local alignment search tool)比对，用DNAMAN软件进行同源性分析，应用Mega7.0软件构建16S r DNA系统进化树，确定分离菌的种属。

表2 欧文氏菌参考菌株信息

耐药基因检测

引物设计

参照相关文献，并自行依据引物设计原则(引物长度为15～30 bp/18～27 bp，不得超过38 bp，且GC含量为45%～55%最好)分别设计合成3种常见的广谱抗生素类耐药基因引物。

3种常见抗生素分别为四环素类、氨基糖苷类、磺胺类。

所有耐药基因的引物序列、体外扩增产物长度及退火温度如表3所示。

表3 耐药基因引物序列

耐药基因的PCR检测

以分离菌的基因组作为模板，用不同耐药基因的引物进行PCR扩增，反应体系和循环条件参照分离菌PCR扩增的条件进行(耐药基因的退火温度具体见表3)。

PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶试验，用凝胶系统观察结果并记录。

试验结果与分析

细菌分离与革兰氏染色

从沐川乌骨黑鸡肠道菌群中分离出1株菌株，将该分离菌命名为S21。

经革兰氏染色镜检确定为革兰氏阴性杆状菌，有鞭毛。

在普通培养基上可见圆形、黄色、中间隆起、表面光滑的菌落。

生化鉴定

生化鉴定结果见表4。

分离菌S21甘油复红试验为阳性，能发酵阿拉伯糖、麦芽糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇和肌醇，不能发酵木糖醇；吲哚试验为阳性；脲酶试验为阴性。

参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》中的细菌生化指标特征判断，分离菌S21的生化鉴定结果与欧文氏菌基本一致。

表4 分离菌的生化鉴定结果

注：“+”表示反应呈阳性；“-”表示反应呈阴性。

药敏试验

如表5所示，分离菌S21除对环丙沙星、氧氟沙星、头孢氨苄表现为敏感，对四环素表现为中介以外，对其他所试抗生素均表现为耐药。

16S r DNA基因PCR扩增

扩增结果如图1所示，得到一条清晰的、大小约为1500 bp的条带，与目的条带大小接近，与预期结果相符。

16S r DNA同源性比对和遗传进化分析

结果显示，分离菌株与8株参考菌株的同源性在99.85%～100.0%之间(图2)，且这株细菌与发表的菌株KUDC3005(Gen Bank登录号：MK070123.1)同源性最接近，高达100.0%。

KUDC3005菌株来源于韩国，已被鉴定为欧文氏菌，由此从分子水平上可将分离株S21确定为欧文氏菌。

表5 分离菌的药敏试验结果

注：依据国际标准进行判定，抑菌圈直径≥20 mm为敏感“S”；抑菌圈直径15～19 mm为中介“I”；抑菌圈直径≤14 mm为耐药“R”。

图1 16S r DNA扩增结果 注：M为DNAMaker;1为阴性对照；S21为分离菌。

图2 16Sr DNA基因序列源性比对

耐药基因的检测结果

如图4所示，耐药基因经PCR检测后，rmt A、tet E、pgi基因电泳检测结果片段大小与预期片段大小一致；除此之外，其他所试耐药基因均未检出。

图3 16S r DNA基因系统进化树

图4 耐药基因检出结果

注：M为DNAMar ker DL2000;1为阴性对照；2为t et A;3为t et O;4为t et W;5为t et Q;6为r mt A;7为s t r A;8为t et M;9为t et X;10为ant(3'')-I;11为aac (3)-I;12为t et E;13为pgi;14为pmi;15为s ul 2;16为s ul 3。

欧文氏菌作为大自然中常见的细菌，多数分布于土壤和水资源中，植物体是其最易感的宿主，多数类型的植物均可被其侵染。

笔者从正常健康的成年鸡肠道中分离出1株菌株S21，经革兰氏染色、生化鉴定、16S r DNA等分子生物学鉴定手段最终确定为欧文氏菌。

欧文氏菌的相关报道主要集中于植物宿主，家禽类动物体宿主的相关报道较少见。

本试验选择的是一批健康的成年鸡，并未出现患病症状。

欧文氏菌可引起植物坏死、软腐、萎蔫等症状，是植物界中引发病害的主要一类病原菌。

植物界中被感染的案例已有大量报道，如果蔬果和树木等报道[15,16,17,18,19,20]。

本次试验从健康鸡的肠道菌群中分离出欧文氏菌，该菌并未影响鸡的正常活动，未表现出患病症状。

在动物体内，小到昆虫，大到牛、羊、猪等，各种动物体内的肠道细菌菌群的组成具有丰富的多样性和差异性，各类细菌都在其体内发挥不同的功能。

此前，李文红等在小菜蛾的肠道菌群中分离出欧文氏菌。

欧文氏菌和蒙氏肠球菌在小菜蛾体内的细菌数量占比最多，欧文氏菌并未对小菜蛾产生致病性。

研究者推测，2类数量占比最多的菌种可能对小菜蛾的各项生理功能起着重要作用。

各类细菌在肠道内发挥其特定作用，细菌之间存在拮抗作用，使肠道菌群处于一个动态平衡的状态。

肠道微生物种类和丰富度可能和鸡的年龄、饲料、养殖环境等相关联。

若鸡体内肠道微生物区系平衡被打破，鸡或将出现致病现象。

耐药性试验表明，试验分离的欧文氏菌对多西四环素、米诺环素、复方新诺明、氯霉素、新霉素、红霉素、苯唑西林均表现为耐药。

耐药基因检测结果显示，该欧文氏菌有rmt A、tet E、pgi 3种耐药基因，这可能与该养殖场不规范使用抗生素有关。

在养殖业中，很多养殖者常常凭经验饲养，凭感觉用药，尤其是遇到传染性疾病的时候，就立刻下猛药。

除此之外，饲料也通常是抗生素添加的载体。

很多饲料生产厂家为了提高动物生产性能，改善饲料转化效率，预防疾病等，在饲料中大量添加抗生素，往往造成畜牧产品抗生素残留超标，同时也导致耐药基因的产生。

解淀粉欧文氏菌是欧文氏菌属中对植物危害最大的菌种之一，最早发现于19世纪末期。

欧文氏菌在动物体内发现案例目前较少，本次动物并未出现患病现象，可进一步研究欧文氏菌在动物体内发挥的作用以及作用机制，以此增进对欧文氏菌的了解，从而提前探讨有效的防控措施。

《一株欧文氏菌的分离及其溶藻特性的研究》

《土壤中解磷、解钾微生物研究进展》

《一株新的溶磷草生欧文氏菌的分离、鉴定及其溶磷效果的初步研究》