根据最新统计，肺癌占世界癌症相关死亡人数的11.4%，是癌症相关死亡的主要原因。
不同亚型的NSCLC发展进程各有特点，了解其发生的不同阶段分子机制有助于制定治疗措施，提高疗效和改善预后。
越来越多的证据表明异常表达的基因或基因产物可作为NSCLC的预后生物标志物。
髓细胞白血病1(myeloidcellleukemia-1，MCL-1)在许多癌症中过表达，与化疗耐药性和复发有关，是开发新型抗癌药物最有吸引力的靶点之一。
目前国内外对MCL-1是否可作为NSCLC潜在预后标志物仍未有定论，且缺乏对MCL-1与NSCLC细胞生长特性及肿瘤恶性进程的相关研究。
基于此，本研究采用生物信息学方法分析MCL-1在NSCLC患者中的表达、参与的分子生物学过程及其与预后的相关性，构建过表达MCL-1的NSCLC细胞模型，探讨MCL-1在肿瘤恶性进程中的作用及对常用化疗药物的敏感性，以期为MCL-1作为NSCLC新的预后标志物及治疗靶点的研究提供参考。
使用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.org)在线分析MCL-1在LUAD和LUSC各分期的表达情况。
使用Kaplan-MeierPlotter数据库(http://kmplot.com)的肺癌数据集在线分析总生存期(overallsurvival，OS)与MCL-1表达的关系。
使用HPA数据库(http://www.proteinatlas.org)的肺癌、LUAD、LUSC数据集在线分析生存预后与MCL-1表达的关系。
使用STRING数据库(http://string-db.org)对与MCL-1相互关联的基因进行GO和KEGG富集分析。
GEPIA数据库检索条件：(1)Gene:MCL-1;(2)Usemajorstage:Yes;(3)Datasets:LUAD或LUSC。
Kaplan-MeierPlotter数据库检索条件：(1)Cancer:Lungcancer;(2)Gene:MCL-1(3个不同ID样本分别为214056-at，200796-s-at，214057-at);(3)Survival:OS。
HPA数据库检索条件：(1)Gene:MCL-1;(2)PATHOLOGY:LUNGCANCER/LUAD/LUSC。
STRING数据库检索条件：(1)ProteinName:MCL-1;(2)Organism:Human;(3)Pathway:KEGG;(4)P<0.05。
进行GO功能注释和KEGG通路富集功能。
人NSCLCHCC827、H1299和PC9细胞株由广西医科大学生命科学研究院细胞与免疫实验室提供。
RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，DMSO购自阿拉丁试剂上海有限公司，质量分数为4%的多聚甲醛购自美国Blosharp公司，MTT购自北京索莱宝科技有限公司，MCL-1RabbitmAb购自美国Thermo公司，GAPDHRabbitmAb购自广州晶欣生物科技有限公司，MCL-1慢病毒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中阴性对照慢病毒滴度为6.44×109 TU/mL，人MCL-1过表达慢病毒滴度为6.46×109 TU/mL。
多功能酶标仪购自美国BioTek公司，Odyssey双色红外成像系统购自美国Licor公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司，EVOSFLAuto细胞成像系统购自美国Lifetechnologies公司。
定量后，取30μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，质量分数为5%的脱脂奶粉封闭1h，洗膜，一抗孵育(1∶1000)过夜，之后二抗(1∶15000)避光孵育1h，TBST洗膜，用Odyssey红外扫膜仪进行扫膜，获得图像结果。
通过ImageJ软件计算蛋白条带灰度值。
取细胞密度为4×104 个/mL的HCC827细胞，接种于96孔板，培养24h;将病毒滴度为1×108 TU/μL空载(NC)和MCL-1质粒100μL分别加入到HCC827细胞，感染24h后，更换完全培养基，每2～3d加入2g/L嘌呤霉素筛选细胞，7d后荧光显微镜下观察细胞荧光强度，直至转染率达到90%以上。
采用蛋白质印迹法比较2组细胞中MCL-1蛋白表达水平，确定过表达MCL-1的HCC827MCL-1细胞模型的成功构建。
取细胞密度为500个/mL的HCC827NC和HCC827MCL-1细胞，接种于5块6孔板中。
继续培养10d，分别在2、4、6、8和10d终止培养。
弃培养基，加入4%多聚甲醛1mL固定后，用质量分数为0.1%结晶紫染色30min，磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)清洗后，显微镜下拍照，计数>50个细胞的集落，计算细胞克隆形成情况。
取100μL细胞密度为5×105个/mL的HCC827NC和HCC827MCL-1无血清培养基的细胞加入到人工基膜包被的Transwell上室中，再向下室加入650μL含体积分数为10%血清的1640培养液。
24和48h后，用棉签除去留在上室表面膜上的细胞，将细胞用4%多聚甲醛室温固定30min，0.1%结晶紫室温染色30min。
在荧光显微镜下(×20)进行观察、计数并拍照。
取细胞密度为1×105 个/孔的HCC827NC和HCC827MCL-1细胞接种至24孔板。
当细胞生长到80%～90%汇合度时，用200μL移液器吸头垂直于孔底部进行划痕，保证每个孔中的划痕基本一致。
用PBS洗涤2次后，将细胞在无血清的1640培养基中培养。
使用显微镜(×10)观察并拍照0、24和48h时的划痕宽度，根据下列公式计算划痕愈合率。
划痕愈合率(%)=1−终点划痕宽度0h划痕宽度×100%(%)=1-终点划痕宽度0h划痕宽度×100%
倍增时间(doublingtime，DT)检测：将20000、10000、5000、2500和1250个细胞分别接种于96孔板，重复3孔，采用MTT法测定每孔的光密度D值，绘制吸光度值与细胞浓度的标准曲线。
取细胞密度为800个/孔的HCC827NC和HCC827MCL-1细胞，接种于96孔板，设置3个平行孔，分别在培养箱中培养0、1、2、3、4、5和6d，加入MTT溶液。
反应4h后，每孔加入150μLDMSO溶液，放在摇床摇10min，在490nm处检测光密度D值。
根据标准曲线，计算培养不同时间的细胞数，并根据下列公式计算细胞的DT值。
DT=t⋅lg2lgNt−lgN0其中t为培养时间，N0为接种的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。
药物的敏感程度检测：取细胞密度为4×104 个/mL的HCC827NC和HCC827MCL-1细胞，接种于96孔板，细胞贴壁后，添加浓度为25μmol/LDDP和TXT的完全培养基。
72h后，在显微镜下观察各组细胞形态。
加入MTT溶液，反应4h后，每孔加入150μLDMSO溶液，在490nm处检测光密度D值。
在相同浓度作用下，根据下列公式计算各组细胞的抑制率。
细胞生长抑制率(%)=(1−加药组D值空白组D值)×100%(%)=(1-加药组值空白组值)×100%
采用PhotoshopCC2020和GraphpadPrism8.0进行图像数据处理分析。
SPSS20.0统计分析软件对实验所得数据进行统计学分析，计量资料以x−±s表示，组间均数比较采用t检验，多组间比较采用F检验，生存分析采用log-rank检验。
检验水准α=0.05(双尾)。
GEPIA数据库分析结果显示，MCL-1在LUAD和LUSC各分期中均高表达，且随着肿瘤的恶化，Ⅳ期患者的MCL-1表达有升高的趋势，但差异无统计学意义，P>0.05。
Kaplan-MeierPlotter数据库分析结果显示，3个不同ID样本的MCL-1基因表达水平对肺癌患者的OS具有显著影响。
MCL-1高表达患者中位OS分别为64.1、62.0和64.1个月；MCL-1低表达患者中位OS分别为76.0、79.3和75.4个月；log-rank检验结果显示，差异有统计学意义，P值分别为0.003、<0.001和0.041。
HPA数据库分析结果显示，肺癌、LUAD和LUSCMCL-1高表达患者的5年生存率分别为38%、30%和41%，低表达患者分别为51%、42%和51%，log-rank检验结果显示，差异有统计学意义，P值分别为0.024、0.029和0.031。
使用STRING数据库构建MCL-1相关蛋白网络图，预测发现10个功能蛋白与MCL-1的编码蛋白相互作用，其中包括调控肿瘤细胞凋亡的PMAIP1、p53/TP53、BAK1、c22orf29蛋白及参与药物内吞转运和细胞有丝分裂的BECN1蛋白。
GO和KEGG分析结果显示，MCL-1相关蛋白主要富集于凋亡过程调控、细胞增殖、DNA损伤响应等139类生物学过程(biologicalprocess，BP)，并参与48条信号通路包括细胞凋亡通路、癌症中微粒蛋白通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、铂类耐药性和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)酪氨酸激酶*制剂抑**耐药性等通路。
蛋白质印迹法结果显示，3种NSCLC细胞H1299、HCC827、PC9的MCL-1相对表达量分别为0.51±0.02、0.14±0.01和0.62±0.01，F=772.3，P<0.001。
HCC827细胞MCL-1表达量最低，因此，选用HCC827细胞株用于过表达MCL-1细胞模型的构建。
慢病毒转染HCC827细胞并经嘌呤霉素筛选后，采用荧光显微镜观察，结果显示，HCC827NC空载细胞和含MCL-1基因的HCC827MCL-1细胞其感染率均>90%。
蛋白质印迹法检测结果显示，转染MCL-1慢病毒后，HCC827MCL-1细胞中MCL-1蛋白的表达量高于转染空载病毒的HCC827NC细胞，其相对表达量分别为0.21±0.02和0.13±0.01，t=4.245，P=0.032。
提示过表达MCL-1的HCC827MCL-1细胞构建成功。
克隆形成实验结果显示，在培养的第10天，HCC827NC组克隆细胞数为(274±10)个，HCC827MCL-1组为(315±9)个，t=5.203，P=0.007。
同时，通过检测2株细胞的DT发现，HCC827NC细胞与HCC827MCL-1细胞DT分别为(26.38±2.17)和(17.15±1.63)h， t=5.887，P=0.004。
提示HCC827MCL-1组细胞生长速度更快。
Transwell实验结果显示，24和48h时HCC827NC组穿过小室的细胞数分别为(18±4)和(225±6)个，HCC827MCL-1组分别为(109±17)和(389±34)个，差异有统计学意义，t值分别为7.771和7.269，P值分别为0.001和0.002。
划痕实验结果显示，24和48h时HCC827NC组细胞划痕愈合率分别为(16.17±0.07)%和(20.46±0.10)%，HCC827MCL-1组分别为(25.88±0.16)%和(30.55±0.29)%，差异有统计学意义，t值分别为125.000和56.820，均P<0.001。
MTT实验结果显示，DDP作用于HCC827NC细胞72h的抑制率为(69.74±0.80)%，HCC827MCL-1细胞为(58.59±3.16)%，t=5.940，P=0.004;TXT作用于HCC827NC细胞72h的抑制率为(54.15±0.42)%，HCC827MCL-1细胞为(43.88±0.55)%，t=25.870，P<0.001。
相同浓度下DDP和TXT对HCC827MCL-1细胞的增殖抑制作用更小，差异有统计学意义，同时光镜下也可观察到相同浓度的DDP和TXT作用72h，HCC827MCL-1细胞存活数量更多，细胞形态保持较好。
肿瘤标志物是一类不存在于正常人组织，或在肿瘤组织中含量大大超过正常组织，存在肿瘤细胞或由肿瘤细胞异常产生的化学物质。
它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的起源、细胞分化和肿瘤的进展等。
肿瘤生物标志物在癌症检测、诊断、患者预后和治疗方案选择中发挥着关键作用。
可用于一种或多种临床情况下的评估和治疗决策，包括风险评估、筛查、预后和监测病程。
如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志物之一；肿瘤抗原(carcinomicantigen，CA)125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物。
此外，一些标志物与肿瘤侵袭性的病程和更高的复发率有关，并对癌症的分期和预后有参考价值。
近年来，国内外对NSCLC的研究越来越多，特别是预后标志物的发现，SD-DEr已鉴定并验证了15种基因特征(ATP1B1、TRIM14、FAM64A、FOSL2、HEXIM1、MB、L1CAM、UMPS、EDN3、STMN2、MYT1L、IKBKAP、MLANA、MDM2、ZNF236)对NSCLC预后的影响。
但是SD-DEr验证的15种基因是对Ⅰ期和Ⅱ期患者的预后价值，对整个NSCLC进展过程的预后价值不明确。
Sun等研究报道CLEC3B在肺癌中表达下调，可能与肺癌的免疫浸润和免疫激活有关，特别是在鳞状细胞癌中，揭示了CLEC3B在肺癌中的诊断和预后潜力，CLEC3B在ⅠA期显著下调，具有早期诊断价值，与肺癌分期呈负相关，但没有单独研究与NSCLC的关系。
因此，目前临床上仍然缺乏NSCLC预后的生物标志物。
本研究采用生物信息学分析发现，MCL-1表达与NSCLC分期呈正相关，分期越高表达水平越高，且MCL-1高表达患者预后更差。
Munkhbaatar等也发现NSCLC组织中MCL-1的表达显著高于癌旁组织，表明MCL-1表达与NSCLC进程密切相关，通过检测MCL-1的表达变化或可判断NSCLC患者的预后情况。
MCL-1基因是BCL-2家族的抗凋亡成员，定位于染色体lq21上，多种癌症组织类型中观察到其局部扩增，如肺癌和乳腺癌中MCL-1区域的荧光原位杂交显示了更高的局部扩增率。
此外，在化疗和放疗中，膀胱癌患者细胞中BCL-2的过度表达是一个不良的预后标志物。
Nakano等通过回顾性分析80例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者(仅接受过手术治疗)，发现NSCLC患者中MCL-1的表达与凋亡指数呈负相关，与Ki-67呈正相关，MCL-1或可作为NSCLC的潜在预后生物标志物。
MCL-1是线粒体凋亡途径主要调节因子，可以降低线粒体外膜通透性和抑制线粒体释放细胞色素C，是神经系统、T/B淋巴细胞和心肌细胞等生长所必需的。
MCL-1通过与BH3(Bim、tBid、Puma、Noxa和Bik/Nbk)蛋白或Bak、Bax和Bok结合来防止细胞凋亡。
相关研究发现，MCL-1能够在多种癌症中促进细胞侵袭迁移，包括三阴性乳腺癌和胰腺癌等。
相反，在患有胰腺癌的异种移植小鼠模型中，敲低MCL-1导致肿瘤大小和质量降低。
本研究通过GO和KEGG富集分析得出MCL-1涉及的BP有凋亡过程调控、细胞增殖和DNA损伤响应等139类过程，参与的信号通路包括细胞凋亡通路、癌症中微粒蛋白通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、神经营养因子信号通路、铂类耐药性和EGFR酪氨酸激酶*制剂抑**耐药性等48类通路。
有研究证实，在肝癌、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤和急性髓性白血病等肿瘤中抗凋亡蛋白MCL-1呈现高表达状态，下调MCL-1蛋白表达量可以促进肿瘤细胞凋亡，提高化疗药物敏感性。
为明确MCL-1在NSCLC中的生物学功能及其对NSCLC恶性进程的影响，本研究构建了过表达MCL-1的NSCLCHCC827细胞模型并进行验证，发现与HCC827NC相比，HCC827MCL-1细胞克隆形成能力增强，DT缩短，侵袭迁移能力增强，同时细胞对DDP和TXT的药物敏感性明显降低，提示MCL-1的过表达可促进NSCLC的生长、侵袭、转移等恶性进程，并降低细胞对化疗药物的敏感性，从而导致了NSCLC的预后不良。
有研究发现，敲除NSCLC细胞的miR-15b可抑制GSK-3β/MCL-1通路，部分逆转了NSCLC细胞对DDP的耐药性。
综上所述，本研究结果表明，MCL-1的高表达与NSCLC的发展、不良预后和耐药性密切相关，MCL-1或可作为NSCLC的预后潜在生物标志物。
但本研究还存在一定的局限性，MCL-1作为NSCLC预后潜在生物标志物，还需要进一步使用动物模型体内验证，并结合临床数据以揭示其临床应用价值。