第二章 舍曲林对心肌梗死后抑郁大鼠行为学及心脏电生理的影响及其机制研究
引言
1. 抑郁与冠心病 20世纪80年代，单纯的生物医学模式转变为多元化的生物心理社会医学模式，人们开始关注心理健康，从身心医学的角度来研究疾病。随着经济的发展和社会压力的增加，精神障碍已成为世界的第四大疾病，严重影响人们的身心健康；心血管疾病，特别是冠心病(coronary artery heart disease，CHD)，则是世界上致死率、致残率及发病率很高的疾病之一。近年来发现，压力、抑郁等精神因素与心血管疾病的关系十分密切，焦虑、抑郁等精神因素是冠心病的独立危险因素；同时，心血管疾病患者的抑郁症发病率亦明显高于一般人群。在冠心病患者中，抑郁症的发病率约为40%，是正常人群的5倍左右。越来越多的心血管疾病患者合并心理疾病，这两种疾病互为因果，相互影响，导致疾病恶化，两者的共病问题已成为我国严重的健康问题之一，应引起临床工作者的高度关注。
大量的临床研究证实，抑郁症患者心律失常及其他心脏功能异常的发生概率较非抑郁症患者明显增高。一项Meta分析表明，心肌梗死后抑郁是心脏性猝死独立的危险因子，可增加恶性心律失常发生率，增加心血管事件住院率及死亡率，降低患者总体生活质量，严重影响临床结局。另一项Meta分析显示，合并有抑郁症的心肌梗死患者心脏性死亡率增加2.4倍，心血管事件发生率增加2倍。然而心理疾病与心血管疾病之间的相互影响及机制尚不清楚，因此探讨其发生机制，寻找合适的治疗策略显得尤为重要。
2. 选择性5-羟色胺再摄取*制剂抑** 选择性5-羟色胺再摄取*制剂抑**(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)是一类新型抗抑郁药物，包括氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰等。SSRIs通过抑制神经突触细胞对神经递质5-羟色胺(5-serotonin，5-HT)的再吸收，增加突触间隙中可供生物利用的5-HT水平，增强5-HT能神经传递，从而发挥抗抑郁作用。同时，5HT能神经元参与了心血管系统的调节，对维持基础心血管功能及心血管反射功能起重要作用。5-HT系统功能异常可能是精神障碍与心血管疾病的共同发病机制之一。
SSRIs是抑郁症合并心血管疾病的患者中循证医学证据最多、应用最广泛的药物，服用SSRIs 后不仅可显著改善抑郁症状，还可降低冠心病的发病率和死亡率，其中舍曲林应用最为广泛。CREATE及其亚组研究发现在冠心病合并抑郁症患者中选择使用SSRIs治疗安全有效，SSRIs可以在冠心病患者中抑制血小板活性并改善血管内皮功能，显著改善伴有抑郁症的心肌梗死后患者的心率变异性与炎症因子水平，减少心血管事件的发生。临床资料表明，SSRIs对心脏电活动有一定的影响，在体表心电图上可表现为PR间期延长，QRS波群增宽，QT间期延长，且SSRIs可影响血管舒缩中枢和血压，这可能与SSRIs改善心肌梗死后抑郁症患者心血管预后的机制相关。
3.抑郁与NMDA受体 大量的研究表明，应激性抑郁症的发生与海马谷氨酸(glutamate，Glu)含量增加及其受体功能变化有关。谷氨酸为体内重要的兴奋性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中含量最丰富的兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节。而其重要受体之一——N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，被认为是学习记忆中的关键物质。
NMDA受体在大脑皮层中广泛分布，但密度最高的是海马CA1区。海马则是边缘系统的重要组成部分，与中枢神经系统的发育、学习和记忆功能密切相关，是与抑郁症发生相关的主要脑区。生理状态下，活化的NMDA受体引起Ca2+内流，Ca2+与CaM蛋白结合形成的复合物可使CaMK磷酸化激活，可通过激活PI3K-Akt途径、Ras-ERK途径、CREB途径等信号通路及PKA、PKC等下级蛋白，增强内在抗氧化防御系统，抑制促凋亡基因的表达，促进神经元的生长发育。同时，Ca2+内流可触发一系列级联反应，引起质膜去极化，诱导LTP的形成和传递，在突触可塑性的维持及学习记忆的形成中至关重要。然而，在长期慢性应激状态下，HPA轴兴奋性持续增高，糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)释放增加，透过血脑屏障进入脑组织，引起兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAAs)过度释放，与NMDA受体结合，使后者激活。而NMDA受体的过度激活又可反馈性激活HPA轴，使GCs浓度进一步增加，最终导致NMDA受体功能亢进。NMDA受体被过度激活后，与NMDA受体耦联的Ca2+通道开放，大量的Ca2+进入细胞，引起钙超载，造成一系列代谢紊乱，如造成线粒体功能障碍，生成大量自由基，产生核酸内切酶使DNA裂解，破坏细胞骨架等，最终导致神经元功能的异常和坏死，同时影响LTP的形成和传递。此机制与抑郁症的发生有密切关系。NMDA受体拮抗剂氯胺酮则被证实具有迅速、持续缓解抑郁症状的作用。在多种抑郁动物模型中，NMDA受体拮抗剂MK-801等也表现出其抗抑郁样作用。一些研究还发现，三环类抗抑郁药(tricyclic antidepressants，TCAs)可直接与NMDA受体作用，抑制在体NMDA的活性，引起大脑皮层NMDA受体的适应性改变。
NMDA受体是由三种亚基组成的异聚体，包括NR1、NR2及NR3，即GluN1、GluN2和GluN3。其中，NR1有八种不同的亚型(NR1-1a/b~4a/b)，由同一基因剪接而来；NR2包括四种亚型，即NR2A~D；NR3有两种，NR3A和NR3B；NR2和NR3分别由六种不同基因编码。其中NR1(核心亚基)是其功能发挥所必需的组分。本研究运用Western Blot方法半定量分析了实验动物海马中NR1亚基表达的变化，以阐述心肌梗死后抑郁大鼠行为学变化的发生机制。
4. 抑郁与心脏电生理 在无心血管疾病的人群中研究发现，抑郁导致亚临床型左心室结构和功能的改变，包括左心室舒张功能下降和重量增加，并与抑郁的严重程度成正比，提示抑郁持续影响心功能，增加心血管疾病的发生风险。临床资料显示，抑郁可增加冠心病患者室性心律失常的发生率，对室性心律失常有预测价值，心肌梗死后抑郁患者QT离散度增大、心率变异性(heart rate variability，HRV)降低；Grippo等发现抑郁模型大鼠基础心率增加、心率变异性降低、室性心律失常阈值降低，这些都是心肌梗死后室性心律失常发生率增加的危险因素，而其具体分子机制尚不清楚。
心室肌电生理特性受多种离子通道的调节，其中瞬时外向钾通道(Kv4.2)是形成瞬时外向电流Ito的重要离子通道蛋白，介导心脏动作电位的早期复极阶段，主要参与心肌细胞动作电位复极1期。Kv4.2表达下降使Ito电流密度减低，复极时间相对延长，容易引起传导阻滞，形成折返而导致室性心律失常的发生。L型钙通道(L-type calcium channel，LTCC)则参与介导心肌细胞的去极化，其功能的异常会触发心律失常，易导致早期后除极(EAD)和尖端扭转型室性心动过速(TdP)。构成心肌细胞L型钙通道电流的重要亚单位有α1C、β2、α2/δ，产生功能钙通道分子的亚单位是α1C亚单位。本实验中检测了Kv4.2和L型钙通道α1C亚单位的表达变化，以期阐述心肌梗死后抑郁大鼠心脏电生理特性变化的分子机制。
本实验集中于研究舍曲林对心肌梗死后抑郁大鼠行为学及心脏电生理特性的影响，并探讨潜在的分子机制，进一步阐述心肌梗死后抑郁症的发生发展，探讨抑郁症对心血管系统的影响，为心脏心理共病的治疗提供理论依据。
第一节 舍曲林对心肌梗死后抑郁大鼠行为学的影响
一、材料
1.实验动物 SPF级成年健康雄性SD大鼠80只，体重150~200 g，由武汉大学动物实验中心提供，置于武汉大学人民医院动物房饲养，饲养条件符合实验要求。
2. 主要实验仪器
(1) 动物行为自动跟踪分析系统(Ethovision 3.0，荷兰Noldus公司)。
(2) 小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。
(3) LEAD 2000B多道生理记录仪(四川锦江通用实业有限公司)。
(4) 其他实验常用耗材均由武汉大学心血管病研究所提供。
3. 主要药品
(1) 盐酸舍曲林片(辉瑞公司)，50 mg/片，以0.9% NaCl溶液配制成0.2%药液，在常温下储存。
(2) 戊巴比妥钠，使用时以0.9% NaCl溶液配制成1%药液，在常温下储存。
(3) 青霉素钠(华北制药集团有限责任公司)。
二、实验方法
1. 实验动物分组 SPF级成年健康雄性SD大鼠80只，体重150~200 g，由武汉大学动物实验中心提供，置于武汉大学人民医院动物房饲养。正常饲料喂养，自由饮食，光/暗周期为12 h /12 h(光照时间6：00-18：00)，室温保持在(20±3) ℃，饲养环境应尽量保持安静，以避免噪声等刺激对动物带来的影响。所有动物在实验室适应环境1周后，用旷场实验对它们进行行为学评分，选择得分相近的大鼠并随机分为五组：正常对照组(n=10)，心梗组(n=20)，抑郁组(n=10)，心梗后抑郁模型组(模型组，n=20)，心梗后抑郁+舍曲林干预组(舍曲林组，n=20)。
2. 动物处理方法
(1) 正常对照组：正常喂养，每天用5 mL/kg生理盐水灌胃，从造模后第1天开始至实验结束，连续28天。
(2) 心梗组：正常喂养，于第1天行冠状动脉左前降支结扎制作心梗模型，每天用5 mL/kg生理盐水灌胃，从造模第1天开始至实验结束，连续28天。
(3) 抑郁组：正常喂养，按程序每天予以慢性温和应激刺激，同时每天用5 mL/kg生理盐水灌胃，从造模第1天开始至实验结束，连续28天。
(4) 模型组：正常喂养，冠状动脉左前降支结扎制作心梗模型后，按程序每天予以慢性温和应激刺激，同时每天用5 mL/kg生理盐水灌胃，从造模第1天开始至实验结束，连续28天。
(5) 舍曲林组：正常喂养，冠状动脉左前降支结扎制作心梗模型后，按程序每天予以慢性温和应激刺激，同时每天用0.2％舍曲林药液(5 mL/kg)单次灌胃，从造模第1天开始至实验结束，连续28天。
模型制作完成后，于实验第5周进行行为学指标检测。
3. 心梗后抑郁大鼠模型的建立 根据文献将急性心梗模型与慢性轻度不可预见性应激抑郁模型结合建立心梗后抑郁大鼠模型。
(1) 急性心梗模型的建立：运用冠状动脉左前降支结扎法制作急性心梗模型。大鼠称重，应用1%戊巴比妥钠溶液(5 mL/kg)经腹腔注射麻醉，麻醉后仰卧固定于实验用木板上。分别在大鼠的四肢及皮下安放心电图记录接触电极，连接LEAD 2000B多道生理记录仪，记录体表心电图。颈部备皮消毒后，于颈部正中切开皮肤，钝性分离暴露气管，于第2~3气管环间插入气管插管，连接小动物呼吸机人工通气(压力2~3 kPa，频率68次/分，呼吸比设为1∶1)，以观察胸廓，胸廓抬举良好作为辅助呼吸成功的标志。在左胸前备皮消毒，于胸骨正中偏左约1 cm，以第2肋和第5肋为上下界，纵行切开皮肤，切口长约3 cm，利用止血钳钝性分离皮下组织、肌肉，再用止血钳夹住肋骨1 min左右，待肋间血流中断后，小心剪断第3、4根肋骨。用开胸器撑开胸廓后，用镊子小心撕开心包膜，将胸腺向右上方推开，暴露心脏。在左心耳根部下1～2 mm处用7-0无创缝线结扎冠状动脉左前降支，进针方向应与左心耳边缘平行，深度为1~1.5 mm。手术中应严格控制结扎位置和深度的一致性，使心肌缺血梗死范围固定、一致。以结扎后局部心肌由鲜红变为暗紫，搏动减弱，外膜苍白，室壁运动明显减弱，且心电图Ⅰ、Ⅱ、avL导联ST段抬高0.2 mV，作为手术成功的标志，观察数分钟以明确心脏搏动恢复正常，减少术后早期因心律失常所致的死亡。逐层缝合胸部切口肌肉组织及皮肤，关胸。拔除气管插管，缝合气管外皮肤。术后每天肌内注射青霉素80万U共三天，预防感染。
(2) 慢性不可预见性温和应激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)抑郁模型的建立：CUMS抑郁模型是经典的抑郁模型之一。抑郁组、模型组和舍曲林组大鼠从心梗手术后第2天开始，每天随机给予1种轻度应激刺激，每天刺激时间不同，同种刺激不连续出现，以使动物不能预料刺激的发生，持续4周。这些刺激包括：鼠笼45 ℃倾斜24 h，铺潮湿垫料24 h，行为限制2 h，4 ℃冰水游泳5 min，42 ℃热水游泳5 min，禁食24 h，禁水24 h，夹尾1 min，鼠笼摇晃15 min，昼夜颠倒24 h，捕食者声音刺激30 min。对照组及心梗组不予任何刺激。
4. 行为学指标检测
(1) 糖水消耗实验：实验前先训练大鼠适应饮用蔗糖水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24 h，两瓶均装有1％蔗糖水，随后的24 h，一个瓶装1％蔗糖水，另一个瓶装纯水。禁水24 h后，进行动物的基础糖水/纯水消耗实验：同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水，一瓶1％蔗糖水和一瓶纯水。2 h后，取两瓶水再次称重，记录大鼠蔗糖水消耗量及纯水消耗量，计算动物的糖水偏爱百分比(糖水偏爱百分比=蔗糖水消耗量/总液体消耗量×100%)。
(2) 旷场实验(open field test，OFT)：本实验所用旷场大小为120 cm×90 cm×35 cm，内面涂黑，实验在早9：00—10：00安静的房间内进行。将大鼠置于旷场中心内，使用动物行为自动跟踪Ethovision 3.0系统记录并分析大鼠在旷场内10 min的行为，主要观测指标为大鼠运动总行程及平均运动速度。直立次数(以大鼠两前爪腾空或攀附墙壁且离开地面1 cm，无论大鼠站立多长时间，直至大鼠两前爪放下为直立1次)由研究者自行记录。每只动物单独测试，两只动物之间需彻底清洁旷场，排除大鼠气味的影响。
5. 统计学处理 所有计量数据均以均数±标准差表示，造模前后及两组间比较采用两个独立样本间t检验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)。所有数据均输入SPSS 17.0软件包。以P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1. 动物模型 按照上述分组及造模方法建立心梗后抑郁模型，心梗前后肉眼可见心肌颜色、搏动等的变化及明显动物心电图变化，见图2-1。4周后，共64只实验动物存活，各组分别为：正常组n=10；心梗组n=16；抑郁组n=10；模型组n=13；舍曲林组n=15。舍曲林组生存率(75.0%，15/20)稍高于模型组(65.0%，13/20)。
图2-1 心梗前后动物心电图变化
注：(a)为心梗前大鼠心电图；(b)为心梗后大鼠心电图，箭头指示ST段抬高，与R波融合。
2. 舍曲林对心梗后抑郁动物行为学影响
(1) 糖水消耗实验：与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组糖水摄入量显著降低，分别为(69.50± 9.58)%、(48.75±16.76)%、(39.50±9.61)% vs (85.57±7.94)%，P<0.05)，说明动物快感减少；而与心梗组、抑郁组相比，模型组大鼠糖水偏爱百分比进一步降低(P<0.05)；舍曲林干预后，糖水偏爱百分比较模型组升高((76.63±12.03)% vs (39.50±9.61)%，P<0.05)，见表2-1。
(2) 旷场实验：与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组在旷场实验中的运动总行程缩短，平均运动速度减小，直立次数减少，表明大鼠活动度降低，空间探索减少，差异有显著性(P<0.05)；舍曲林干预后，心梗后抑郁大鼠运动行程增加，直立次数增加(P<0.05)，见表2-1。
注：与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组均有运动减少，直立次数减少，显示大鼠活动度降低，空间探索减少；舍曲林干预后，大鼠运动及直立次数增加。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
第二节 舍曲林对心肌梗死后抑郁大鼠在体心脏电生理特性的影响
一、材料
1. 实验动物 同第一节。
2. 主要实验仪器
(1) 小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。
(2) LEAD 2000B多道生理记录仪(四川锦江通用实业有限公司)。
(3) 多道电子刺激器(SEN-7301，日本)。
(4) 自制针形电极。
(5) 其他实验常用耗材均由武汉大学心血管病研究所提供。
3. 主要实验试剂 戊巴比妥钠，使用时以0.9% NaCl溶液配制成1%药液，在常温下储存。
二、实验方法
于第一节大鼠行为学指标检测完成后，将大鼠用1%戊巴比妥钠溶液(5 mL/kg)经腹腔注射麻醉，麻醉后仰卧固定于实验用木板上。分别在大鼠的四肢及皮下安放心电图记录接触电极，连接LEAD 2000B多道生理记录仪，记录体表心电图。颈部备皮消毒后，于颈部正中切开皮肤，钝性分离暴露气管，于第2、3气管环间插入气管插管，连接小动物呼吸机人工通气(压力2~3 kPa，频率68次/分，呼吸比设为1∶1)，以观察胸廓，胸廓抬举良好作为辅助呼吸成功的标志。左前胸备皮消毒，于胸骨正中偏左约1 cm，以第2肋和第5肋为上下界，纵行切开皮肤，切口长约3 cm，利用止血钳钝性分离皮下组织及肌肉，小心剪断第3、4根肋骨。用开胸器撑开胸廓后，将胸腺向右上方推开，暴露心脏。参比电极夹在胸前皮下组织下，记录电极放置于心梗周边区前壁，深度约1 mm，连接记录仪，进行大鼠在体心脏电生理特性的记录和检测。以冠状动脉结扎线为标志，梗死苍白区边缘及周围3 mm以内定义为心梗周边。未行心梗手术组则置于心脏相应部位。
1. 单相动作电位(monophasic action potential，MAP)记录 在窦性心律情况下，记录大鼠心室肌单相动作电位。分析动作电位时按以下标准选择：①基线平稳；②可稳定记录动作电位5 min以上；③除动作电位上升支起始部偶有心电引起的伪迹外，其他部位无任何伪迹；④取连续10个动作电位的均值计算各参数。计算MAPD90(从MAP起始到复极完成90%的时间)。
2. 心室有效不应期(ventricular effective refractory period，VERP)检测 采用S1S2刺激法测定心室有效不应期(VERP)。双极刺激电极置于心梗周边区，深度为1 mm左右，两电极相距约2 mm。未行心梗手术组置于心脏相应部位。先用S1S1刺激法测定阈电压，设置S1S1间期为150 ms，脉宽2 ms，电压逐渐增加，能引起8个以上连续心室激动的最小电压即为阈电压。再采用S1S2刺激法测定心室有效不应期(VERP)。S1S1间期为150 ms，期前刺激S2脉宽和电压与S1相同，在连续发放8个起搏刺激后发放期前刺激S2，S1S2间期从150 ms开始，S2以2 ms的时距递减。负向扫描至S2不能引起各部位心室肌去极化为止时，即为VERP。计算VERP/MAPD90值。
3. 室颤阈值(ventricular fibrillation threshold，VFT)测定 检测VERP后，用短阵高强度刺激法测定VFT。双极刺激电极仍置于心梗周边区，深度1 mm左右，两电极相距2 mm。用电子刺激器施加短阵高强度刺激，周长20 ms，脉宽4 ms，每次刺激持续时间5 s，间断2 s后进行下一次刺激。从能引起心室激动的阈电压开始，每次递增2 V，至可引起持续性室颤(间歇期室颤不能完全恢复)时，再以1 V递减负向扫描，重复三次，以可引起持续性室颤的最低电压为VFT。
4. 统计学处理 所有计量数据均以均数±标准差表示，造模前后及两组间比较采用两个独立样本间t检验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)。所有数据均输入SPSS 17.0软件包。以P<0.05为差异有统计学意义。
图2-2 心脏电生理检测结果示意图
注：(a)为各组MAP记录示意图；(b)为实验中所诱发室颤示意图。
三、实验结果
1. 单相动作电位(MAP)变化 与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组MAPD90均明显延长，其中模型组与心梗组及抑郁组相比，MAPD90亦有进一步的延长。舍曲林干预后，MAPD90较模型组有所缩短，但差异无显著性(P>0.05)(图2-2、表2-2)。
2. 心室肌有效不应期(VERP)及VERP/MAPD90值变化 与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组VERP均显著延长，且模型组VERP较心梗组及抑郁组均延长。舍曲林可使其有所缩短，但无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比，心梗组、抑郁组和模型组VERP/MAPD90值降低，舍曲林干预后可使其升高(P<0.05)(表2-2)。
3. 室颤阈值(VFT)变化 与正常组相比，心梗组、抑郁组及模型组VFT均明显降低((18.00±3.62) mV、(18.67±2.92) mV、(14.67±1.85) mV vs (23.33±3.02) mV)，模型组VFT较心梗组、抑郁组有进一步的降低(P<0.05)；舍曲林的干预使模型大鼠VFT显著提高((20.20±9.32) mV vs (14.67±1.85) mV，P<0.05)(表2-2)。
注：与正常组相比，心梗组、抑郁组及模型组的MAPD90和VERP延长，VERP/MAPD90降低，VFT降低，舍曲林可缩短模型组的MAPD90和VERP，增高VERP/MAPD90值，并显著提高VFT。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
第三节 舍曲林对心肌梗死后抑郁大鼠海马NR1及心肌离子通道表达的影响
一、材料
1. 实验动物 同第一节。
2. 主要实验仪器
(1) 紫外分光光度计(DU-7500，Beckman公司，美国)。
(2) 超低温冰箱(MDF-382E，SANYO公司，日本)。
(3) 超高速低温离心机(L7-65 Ultracentrifuge，Beckman公司，美国)。
(4) 超纯水仪(Milli-Q Academic，Millipore公司，美国)。
(5) 0.22 μm滤器(Whatman公司，美国)。
(6) 移液器(2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 mL,Gilson 公司，法国)。
(7) pH计(Beeklnna 71，美国)。
(8) Mini-Protein Ⅲ垂直电泳仪(Bio-Rad 公司，美国)。
(9) Trans-Blot SD半干转印槽(Bio-Rad 公司，美国)。
(10) 其他实验常用耗材均由武汉大学心血管病研究所提供。
3. 主要试剂
(1) 鼠抗NR1抗体(RBI，Cat.No.M-207，美国)。
(2) 鼠抗Kv4.2抗体(Abcam，ab99040，香港)。
(3) 鼠抗L型钙通道α1C亚基抗体(Sigma，C4980，美国)。
(4) 鼠抗GAPDH抗体(Epitomics，22511，美国)。
(5) PVDF膜(Millipore，美国)。
(6) 预染蛋白Marker(Fermentas，美国)。
(7) 辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(Epitomics，美国)。
(8) BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P1002，上海)。
(9) RIPA裂解液(强)(碧云天，P0013，上海)。
(10) PMSF（一种蛋白酶*制剂抑**)(碧云天，上海)。
(11) BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)(碧云天，P0018，上海)。
4. Western Blot主要试剂的配制
(1) 1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)100 mL：18.165 g Tris碱，80 mL去离子双蒸水，缓慢加浓HCl至pH 8.8(约加4 mL)；溶液冷却至室温后pH将会升高，加去离子双蒸水至100 mL，过滤。
(2) 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)100 mL：12.11 g Tris碱，80 mL去离子双蒸水，缓慢加浓HCl至pH 6.8(约加8 mL)；溶液冷却至室温后pH将会升高，加去离子双蒸水至100 mL，过滤。
(3) 10%SDS 100 mL：5 g SDS加入45 mL双蒸水，加热68 ℃助溶后，调整pH＝7.2，定容到50 mL，常温保存。
(4) 25×电转缓冲液：18.2 g Tris碱，90 g甘氨酸，450 mL水助溶后，调整pH＝8.3，定容到500 mL，常温保存。
(5) 1×电转缓冲液：25×电转缓冲液 20 mL，甲醇100 mL，SDS 0.05 g，450 mL水助溶后，定容到500 mL，常温保存。
(6) 10×TBS缓冲液：12.11 g的Tris碱，90.00 g的NaCl，加去离子双蒸水至1000 mL，可在4 ℃存放数月。
(7) 10×电泳缓冲液：30 g的Tris碱，144 g的甘氨酸，10 g的SDS，加去离子双蒸水至1000 mL，可在常温存放数月。
(8) 30%丙烯酰胺储存液100 mL：29%丙烯酰胺29.0 g，1%双丙烯酰胺1.0 g，60 mL双蒸水加热37 ℃助溶后，调整pH<7，定容到100 mL(固体粉剂体积太大，加水不能过多)，然后液体用漏斗过滤，棕色瓶避光常温保存。
(9) 12%分离胶缓冲液 10 mL：
双蒸水 3.3 mL
30% PAA 4.0 mL
1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8) 2.5 mL
10% SDS 0.1 mL
10% AP 0.1 mL
四甲基乙二胺(TEMED) 0.004 mL
(10) 5%浓缩胶缓冲液5 mL：
双蒸水 3.4 mL
30% PAA 0.83 mL
1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8) 0.63 mL
10% SDS 0.05 mL
10% AP 0.05 mL
TEMED 0.005 mL
(11) 电泳缓冲液：
10×电泳缓冲液 100 mL
去离子双蒸水 900 mL
(12) 磷酸盐吐温缓冲液(PBST)：
1×PBS 1000 mL
Tween-20 1 mL
(13) 5% 脱脂奶粉封闭液(抗体稀释液)100 mL：
脱脂奶粉 5 g
PBST 100 mL
(14) 5×上样缓冲液5 mL：称取1.5 mol/L(pH=6.8)Tris-HCl 2.5 mL、二硫苏糖醇(DTT)0.39 g、SDS 0.5 g、溴酚蓝0.025 g及甘油2.5 mL，将Tris-HCl加入溴酚蓝中，过滤后依次加入甘油、SDS及DTT，定容至5 mL，使用时按样品∶缓冲液=4∶1的比例加入蛋白样品中。
二、实验方法
1. 样本处理 于第二节心脏电生理实验结束后，拔除气管插管，断头处死动物，迅速将大鼠头部置于冰上。稍提起心脏，于主动脉根部剪取心脏。剥离大鼠头部皮肤及颅骨组织部分，迅速于冰上分离脑组织，除去大脑皮层部分，分离大鼠海马。同时，于冰上除去大鼠左、右心耳，并沿室间沟分离左、右心室，剪取左心室心梗周边区游离壁或相应部位心肌组织。所取组织立即用锡箔纸包好投入液氮中防止蛋白变性，分装，在分装袋外用记号笔标记清楚，置于-80 ℃冰箱保存备用。
2. 总蛋白提取及处理
(1) 组织裂解：把组织剪切成细小的碎片。融解RIPA裂解液，混匀。取适量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L。按照每20 mg组织加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液，根据组织裂解情况增加或减少裂解液用量。用玻璃匀浆器在冰上匀浆，直至组织块充分裂解。
(2) 离心：启动离心机预冷，使离心机内温度降至4 ℃。将充分裂解后的溶液转移至EP管内，平衡地置于离心机中，10000~14000 g离心3~5 min，小心吸取上清液，即为总蛋白样品，分装至EP管内。
(3) 蛋白浓度测定：按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。完全溶解蛋白标准品，取10 μL稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL。将标准品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20 μL。加适当体积总蛋白样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。测定A562。根据标准曲线计算出总蛋白浓度。
(4) 蛋白变性处理：剩余蛋白样品按照4∶1比例加入5×蛋白上样缓冲液，混合，用移液器吹打数下，100 ℃沸水变性10 min。置于-20 ℃冰箱内保存。
3. Western Blot检测
(1) 电泳
①清洗玻璃板，冲洗干净后用无水乙醇冲洗晾干。
②玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
③配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，然后在胶上加水密封。
④静置约30 min，待胶充分凝固后，倒去胶上层水，用无水乙醇冲洗2遍后吸干残存乙醇。
⑤配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀，灌胶、插梳。30 min左右，浓缩胶凝固后，将梳子轻轻拔出。置于4 ℃过夜备用。
⑥SDSPAGE电泳：将电泳槽内加入1×电泳缓冲液，电泳缓冲液液面需高于凝胶最上端。每上样孔内加约40 μg已变性的蛋白样品，根据已测得总蛋白浓度计算上样量，用微量进样器吸取相应量，缓慢加入上样孔内，胶的两侧加预染蛋白Marker 4~5 μL，以确定蛋白条带的相对分子质量大小。电压为90 V，电泳至分离胶后电压改为120 V，电泳至溴酚蓝跑至胶最底部即可终止电泳。
(2) 转膜
①准备3张滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜用无水甲醇浸泡1 min，用双蒸水浸洗备用。
②在加有转移液的搪瓷盘里置海绵垫和浸过的PVDF膜。
③打开夹子保持水平，垫上海绵垫，在垫子上垫三层滤纸和PVDF膜，去除其中的气泡。
④除去小玻璃板，刮去浓缩胶，剥下分离胶盖于滤纸上，调整，使其与滤纸对齐。将膜盖于胶上，膜与胶的另一面盖上三张滤纸并除去气泡。盖上另外的海绵垫，小心用玻璃棒除去夹子内的气泡，合起夹子。
⑤将夹子放入转移槽中转膜。电转时在槽的一边放冰以降温。转膜装置置于冰水中，打开电源，电流200 mA转膜1~1.5 h。
⑥转膜完毕后取出夹子，除去滤纸及凝胶，在PVDF膜上做记号以判断膜的正反面。
(3) 免疫反应
①将膜用PBST浸洗3次，每次5 min。将漂洗后的膜取出后置于平皿中，加5%脱脂奶粉封闭液，室温下脱色摇床上摇动封闭2 h。
②从封闭液中取出膜，置于抗体孵育盒中，加入一抗孵育液(5%脱脂奶粉中分别加入抗NR1抗体(1∶1000)、抗Kv4.2抗体(1∶1000)、抗α1C亚基抗体)(检测GAPDH蛋白表达水平作为内参照)，4 ℃孵育过夜后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15 min。
③在5%脱脂奶粉中加入加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗( 1∶3000)，室温孵育1 h，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次15 min。
(4) 化学发光，显影及定影
①将ECL化学发光液中A和B两种试剂等体积混合。用平头镊将PVDF膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体，放置于一洁净的保鲜膜上。
②根据膜的大小，按每10 cm2膜加1 mL ECL液的比例，滴加ECL工作液，确保膜蛋白面与工作液充分均匀接触，避光放置1 min左右，吸去过多ECL液，用保鲜膜包好，放入X光片夹中。
③在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X光片，剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1 cm),打开X光片夹，把X光片放在膜上，关上X光片夹，根据信号的强弱适当调整曝光时间；曝光完成后，打开X光片夹，取出X光片，迅速浸入显影液中显影3 min，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，马上把X光片浸入定影液中，定影5 min，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
④胶片扫描后用凝胶图像处理 Image J系统进行灰度分析，以各目的蛋白光密度(optical density，OD)值与GAPDH蛋白OD值的比值为目的蛋白相对表达量。
4. 统计学处理 以各目的蛋白OD值与GAPDH蛋白OD值的比值为目的蛋白相对表达量，以对照组目的蛋白表达水平为1(100%)，计算各组目的蛋白的相对表达量。所有数据均以均数±标准差表示，两组间比较采用两个独立样本间t检验，多组间比较用方差分析(ANOVA)。所有数据均输入SPSS 17.0软件包。以P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1. 海马NR1表达变化 与正常组相比，心梗组海马NR1的表达量有下降趋势((12±5)%，P>0.05)，差异无统计学意义；抑郁组及模型组分别减少了(30±11)%和(57±9)%；舍曲林干预可增加模型组海马NR1表达((17±6)%)(图2-3)。
图2-3 Western Blot检测半定量海马NR1蛋白表达
注：(a)为各组海马组织NR1蛋白检测结果示意图；(b)为各组海马NR1蛋白的相对表达量。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
2. 心室肌离子通道蛋白表达变化 与正常组相比，心梗组、抑郁组以及模型组心室肌Kv4.2的表达分别减少了(29±12)%、(24±6)%和(41±15)%；舍曲林干预可增加模型组Kv4.2的表达((30±9)% vs (41±15)%)(图2-4)。
与正常组相比，心梗组心室肌α1C亚基表达量有所增加((15±13)%，P>0.05)，无统计学差异；抑郁组及模型组心室肌α1C亚基表达量分别增加了(24±11)%、(95±29)%；舍曲林干预可减少心梗后抑郁大鼠心室肌α1C亚基的表达((19±7)%)(图2-4)。
图2-4 Western Blot检测各组心室肌Kv4.2及LCa2+α1C亚基表达
注：(a)各组心室肌离子通道蛋白检测结果示意图；(b)各组心室肌离子通道蛋白的相对表达量；与正常组相比，心梗组、抑郁组以及模型组心室肌Kv4.2的表达分别减少了(29±12)%、(24±6)%和(41±15)%；舍曲林干预可增加模型组Kv4.2的表达((30±9)% vs (41±15)%)。与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。
四、讨论
随着经济的发展和社会压力的增加，精神障碍已成为世界的第四大疾病，具有发病率高、易反复发病和难治愈等特点。抑郁症是由各种原因所引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍，是以抑郁心境自我体验为中心的临床症候群，主要表现为活动力下降、兴趣丧失及食欲降低等。抑郁症影响机体各组织器官的功能，在心血管系统方面表现为亚临床型左心室结构和功能的改变，包括左心室舒张功能下降和重量增加，以及心率变异性的降低和室性心律失常发生率的增加，并与抑郁症的严重程度成正比，提示抑郁症持续影响心功能，增加心血管疾病的发生风险。在冠心病患者中，抑郁症的发病率增高，约为40%，是正常人群的5倍左右。同时抑郁症患者心血管事件发生率亦增加，抑郁症是冠心病患者猝死的独立危险因子之一。一项Meta分析显示，合并抑郁症的心梗患者心脏性死亡率增加2.4倍，心血管事件发生率增加2倍。但其发病机制尚不清楚，因此研究其发病机制，寻找有效而安全的治疗策略，改善冠心病患者的预后显得尤为重要。
SSRIs是抑郁症合并心血管疾病的患者中循证医学证据最多、应用最广泛的药物，服用SSRIs 后不仅可显著改善抑郁症状，还可降低冠心病的发病率和死亡率。本实验集中于研究SSRI类抗抑郁药舍曲林对心梗后抑郁大鼠行为学及心脏电生理特性的影响及其潜在的分子机制，探讨抑郁对心血管系统的影响，进一步阐述心梗后抑郁症的发生发展，为心脏心理共病的治疗提供理论依据。
1. 心梗后抑郁大鼠模型的建立 动物模型的建立对于人类疾病发生机制及治疗的研究和探讨是十分必要的，借助于动物模型的间接研究，可以人为地改变实验条件，进行反复观察和研究，避免了在人身上进行实验所带来的风险，对某些发病率低、病程长的疾病也能通过有意识的控制进行研究，有助于更准确、方便地认识人类疾病的发生发展规律和研究防治措施，是现代生物医学研究中一个极为重要的实验方法和手段。一个满足需求、可被广泛推广应用的动物疾病模型应能良好地再现所要研究的人类疾病，并具有易复制和专一的特点。常用作疾病模型的动物有大鼠、兔、犬和猪，而大鼠因来源广泛，具有繁殖速度快、成本低、易于饲养等优点，被广泛应用于各种疾病病理机制、新药的筛选和病理特性等方面的研究。
本研究中采用急性心梗模型与慢性不可预见性温和应激模型相结合的方法制作心梗后抑郁模型。
国内外常用的心梗模型可分为诱导性动物模型和自发性动物模型。制作诱导性动物模型的方法主要是人工阻塞冠状动脉造成急性或慢性心肌缺血及梗死，包括血管结扎法、球囊堵塞法、血栓形成法、选择性饮食法、药物法等。冠状动脉结扎法是目前各种心梗模型中应用最早、最广泛的制作方法，通过开胸结扎冠状动脉不同分支部位造成急性心肌缺血，大多结扎冠状动脉左前降支。该模型手术简便，制作方法成熟，重复性好，周期短，可人为控制缺血范围及时间。球囊堵塞法采用介入方法封堵冠状动脉，此方法可避免开胸所致有创损伤，动物恢复快，有利于长期的观察和研究，但其手术要求相对较高，成本高。血栓形成法是通过点刺激、光化学反应法、机械损伤法等诱导冠状动脉血栓形成，造成心肌缺血，手术时间短，损伤小。选择性饮食法则是通过高脂饮食诱导冠状动脉粥样硬化，诱发冠状动脉狭窄与梗死，与人类心梗发病极其相似，但模型制作周期长，不适用于短期观察。药物法常用异丙肾上腺素和垂体后叶素诱导血管收缩，使冠状动脉痉挛，造成心梗，操作简便，但药物作用广泛，梗死范围无法人为控制和计量。自发性动物模型则主要采用具有高度动脉粥样硬化倾向的遗传性高脂血症心梗家兔进行制作。
本实验中急性心梗模型是运用结扎冠状动脉左前降支的方法诱导建立的。心梗手术后的心电图显示对应导联ST段抬高，与R波融合，并且肉眼观察可见梗死区心肌由鲜红变为暗紫，外膜变白，室壁运动明显减弱，表明心梗模型制作成功。
研究发现，应激*生活性**事件是抑郁症的明显促发因素，研究者还认为慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁症的主要原因，并呈剂量反应关系。慢性不可预见性温和应激模型由Katz R J于1981年提出，并逐步发展而成。本模型与人类抑郁症临床特征相似，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机制更为接近，因而被广泛应用。经慢性应激后，动物表现出体重增长明显缓慢、探索行为减少及对新鲜环境的好奇程度降低、自身关注下降等症状，并且这种症状一旦出现，可保持数月。因此慢性不可预见性应激模型能较真实和可信地模拟抑郁症患者的某些症状和病因，是目前应用和研究较多的抑郁模型。
慢性不可预见性温和应激模型主要模拟了人类抑郁症的核心症状，即快感缺乏。本模型脑内奖赏系统内的一些神经元结构受损，导致快乐体验能力的缺乏，可能为此模型快感缺乏的神经结构基础。目前国内外学者多用糖水消耗量和糖水偏爱百分比作为衡量快感缺乏的有效客观指标。同时本模型也伴随其他很多行为的改变，如探索行为减少、睡眠规律紊乱、体重增长缓慢和自发性活动减少。而旷场实验中水平活动得分反映动物的活动度和空间探索能力，垂直活动则反映动物对周围新鲜环境的好奇程度。
本实验中可观察到，4周慢性应激后，抑郁组及模型组大鼠糖水偏爱百分比降低，旷场实验中水平运动距离显著减小，垂直运动次数亦明显减少。由此可见抑郁组及模型组动物表现出快感缺乏、活动能力下降、兴趣丧失，反映其抑郁样行为的发生，表明慢性不可预见性温和应激模型制作成功。
另外，我们观察到，舍曲林的应用可将心梗后抑郁大鼠的死亡率由75%降低至65%，提示舍曲林对心梗后抑郁预后的改善作用。实验过程中的动物死亡原因有多种可能。对于心梗大鼠，术中及术后24~28 h是大鼠主要的死亡时间。术中麻醉过深、大鼠气道分泌物过多、开胸位置不当致严重气胸、术后呼吸机撤离过早等多种原因均可能导致动物的死亡。大鼠左冠状动脉结扎位置过高，心梗面积过大，导致大鼠发生急性心衰或急性恶性心律失常等，均会增加动物死亡率。此外术后可能发生的严重感染也是致死原因之一。由于死因的多样性，本实验结果并不能作为舍曲林改善心梗后抑郁作用的证据，亦不排除样本量小造成的系统误差。
2. 舍曲林对心梗后抑郁大鼠行为学的影响及机制 实验中，心梗大鼠表现出糖水偏爱百分比降低，空间运动亦减少，表明心梗后动物抑郁发生概率升高；模型组大鼠抑郁样行为表现重于心梗动物及抑郁动物，说明心梗及抑郁对动物行为的影响可能存在协同效应；舍曲林干预后行为学检测指标改善，说明舍曲林可改善心梗后抑郁模型的抑郁样行为。此研究结果与临床研究相符。而目前心梗后抑郁的发生机制尚不清楚。既往研究显示，在左冠状动脉结扎的急性心梗大鼠模型中，海马齿状回神经元丢失，神经元凋亡增多，提示心梗与抑郁可能存在共同的脑组织功能受损。舍曲林是一种SSRI类新型抗抑郁药物，可抑制神经突触细胞对神经递质5-羟色胺(5-serotonin，5-HT)的再吸收。5-HT能刺激海马齿状回颗粒细胞的生成，而损伤5-HT系统则会减少神经元的生成。慢性的舍曲林干预可增加突触间隙中可供生物利用的5-HT水平，增强5HT能神经传递，逆转抑郁所致海马神经元损伤，从而发挥抗抑郁作用。
本实验结果显示，抑郁组和模型组大鼠在表现抑郁样行为的同时，海马NR1 亚基表达下降。舍曲林干预后，模型大鼠抑郁样行为得到改善，同时海马NR1亚基表达上调，提示舍曲林可能通过调节海马NR1表达从而改善动物的抑郁样行为。心梗组大鼠海马NR1亚基表达亦有所下降，虽无统计学意义，也提示了NR1在心梗后抑郁发生中可能起的作用。
目前研究表明，应激性抑郁发生与海马谷氨酸(Glu)含量增加及其受体功能变化有关。Glu为体内重要的兴奋性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中含量最丰富的兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节，对于学习、记忆及神经传导等有着重要的作用。Glu与主要的抑制性神经递质——γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)之间的平衡是维持中枢神经系统中生理稳态的必要条件。研究显示，Glu兴奋性中毒与多种中枢神经系统疾病以及精神疾病的发生均有密切关系。Glu在神经末梢中储存于囊泡中，在突触传递中，Glu以胞吐形式释放，进而激活位于突触后的Glu受体。Glu受体激活后，再使相应的效应子发挥作用，从而改变细胞的膜电位和生化状态。根据其与效应子之间功能耦联的关系，Glu受体分为2种主要类型：离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptor，iGluR)和代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor，mGluR)。根据受体选择性激动剂的不同，iGluR分为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受体和海藻酸(KA)受体，后两种受体常合称为非NMDA受体。这些受体都是非选择性阳离子通道，介导氨基酸的快速兴奋性突触传递，调节神经元去极化，参与学习记忆的形成和突触可塑性的维持。其中KA受体、AMPA受体通道维持平时的信息传递，而NMDA受体通道只在学习记忆过程中才开启，因此被认为是学习记忆中的关键物质。
NMDA受体是由三种亚基组成的异聚体，包括NR1、NR2及NR3，亦即GluN1、GluN2和GluN3。其中，NR1有八种不同的亚型(NR1-1a/b~4a/b)，由同一基因可变剪接而来；NR2包括四种亚型，即NR2A~D；NR3有两种，NR3A和NR3B；NR2和NR3分别由六种不同的基因编码。其中NR1 是NMDA 受体的核心亚单位，是其发挥功能所必需的组分，NR2(强化亚基)的介入则修饰了整个受体的功能特性。因NR1亚基是NMDA受体的必需组分，其表达量变化会影响到NMDA 受体的整体功能。
NNMDA受体在大脑皮层广泛分布，但密度最高的是海马CA1区。海马则是边缘系统的重要组成部分，与中枢神经系统的发育、学习和记忆功能密切相关，是与抑郁症发生相关的主要脑区。生理状态下，活化的NMDA受体引起Ca2+内流，Ca2+与CaM结合形成的复合物可使CaMK磷酸化激活，可通过激活PI3K-Akt途径、Ras-ERK途径、CREB途径等信号通路及PKA、PKC等下级蛋白，增强内在抗氧化防御系统，抑制促凋亡基因的表达，促进神经元的生长发育。同时，Ca2+内流可触发一系列级联反应，引起质膜去极化，促进LTP的形成。然而，在长期慢性应激状态下，HPA轴兴奋性持续增高，糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)释放增加，透过血脑屏障进入脑组织，引起兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAAs)过度释放，与NMDA受体结合，使后者激活。而NMDA受体的过度激活又可反馈性激活HPA轴，使GCs浓度进一步增高，最终导致NMDA受体功能亢进。当NMDA受体被打开后，与NMDA受体耦联的Ca2+通道开放，大量的Ca2+进入细胞，引起钙超载，造成一系列代谢紊乱，如生成大量自由基，破坏线粒体功能，产生核酸内切酶使DNA 裂解，破坏细胞骨架等，最终导致神经元功能的异常和坏死，造成神经毒性作用。此机制与抑郁症的发生有密切关系。
研究表明，NMDA 受体过度激活能诱发抑郁，NMDA 受体拮抗剂则具有很好的抗抑郁效果。有研究显示NR1 缺陷小鼠表现出严重的情感淡漠；在海马CA1区NR1基因敲除后的动物模型中，实验动物虽能发育成为大体正常的成年动物，但其学习及空间记忆能力大受影响；另有研究以放射性配体结合技术对抑郁症自杀者与其他原因突然死亡者的大脑进行比较的研究结果表明，前者额叶皮质NMDA受体复合物中高亲和性甘氨酸结合位点的数目减少，NMDA受体拮抗剂结合点亦减少；用原位杂交法对抑郁症自杀者海马进行检测，结果发现其NMDA受体的mRNA表达显著减少，可能是脑内谷氨酸的含量升高而导致NMDA受体功能代偿性下调的结果。非选择性NMDA受体拮抗剂氯胺酮被证实具有迅速、持续缓解抑郁症状的作用。在多种抑郁动物模型中，NMDA受体拮抗剂也表现出其抗抑郁样作用，包括习得性无助模型、慢性应激模型等。有动物研究显示，应用氯胺酮、MK-801等NMDA受体拮抗剂进行治疗后，抑郁动物在强迫游泳实验(forcedswimming test，FST)和旷场实验(open field tests，OFT)中的不动时间减少，提示其具有改善抑郁症状的作用。一些研究还发现，三环类抗抑郁药(tricyclic antidepressants，TCAs)可直接与NMDA受体作用，抑制在体NMDA的活性。大剂量的氟西汀或舍曲林亦可增强MK-801诱发的抗抑郁作用。
NMDA受体除在中枢神经系统内丰富表达外，在外周组织中亦发挥着重要作用，包括心脏、肝、胰腺、脊髓等。研究发现，NMDA受体广泛分布在整个神经系统中，可通过增加Ca2+内流，调节心脏电信号的传导。过度的NMDA受体激活可通过神经传导系统与心肌细胞作用，产生异常电冲动信号，影响心脏自律性，诱发心律失常。因此NMDA受体表达和功能的异常可能是精神障碍与心血管疾病共同的病理过程。
3. 舍曲林对心梗后抑郁大鼠心脏电生理特性的影响及机制 临床资料表明，抑郁可增加冠心病患者室性心律失常发生率，对室性心律失常的发生有预测价值，心梗后抑郁患者QT间期离散度增大、心率变异性降低；Grippo等发现抑郁模型大鼠基础心率增加、心率变异性降低、室性心律失常阈值降低，都是心梗后室性心律失常发生率增加的危险因素，而其具体分子机制尚不清楚。心室肌电生理特性受多种离子通道的调节，本实验拟通过动物模型研究心梗后抑郁对大鼠的心脏电生理特性，以及心室肌瞬时外向钾通道(Kv4.2)、L型钙离子通道(L-Ca2+)蛋白表达的影响，以期阐明其分子机制。
(1) 在体心脏电生理特性变化：MAP是细胞外记录的心肌细胞群局部电活动，其波形能较真实地反映跨膜动作电位(transmembrane action potential，TAP)的形态和时相，尤其是去极化阶段。MAP是心肌细胞群的平均胞外电位，可用于在体完整的搏动心脏，其记录真实再现心脏病的病理生理学。关于其形成机制，目前比较公认的是“损伤电流学说”。静息状态下，细胞膜内电位为负，膜外为正，形成-90 mV的跨膜电位。当记录电极顶端接触心肌细胞时，压力的作用使电极接触部位心肌细胞群产生去极化，使此区域处于电冻结状态，不能主动参与去极化和复极化的过程。邻近部位正常心肌细胞的动作电位传导至此区域时，两区域间的电位差变化形成MAP。近年来，MAP记录已被广泛应用于心律失常的发生机制、抗心律失常药物的评价等多方面的研究。MAP记录的主要指标包括单相动作电位振幅(monophasic action potential amplitude，MAPA)和单相动作电位时程(monophasic action potential duration，MAPD)。MAPD90是从动作单位起始到复极完成90%的时间，可导致心室肌电生理特性不稳定，后除极增加，易于诱发室性心律失常。
心室有效不应期(VERP)则指一段从除极化开始的不能产生动作电位的间期，其长短与动作电位的时间呈正相关。在动作电位时间内，VERP相对延长，即心室有效不应期和动作电位时程比值(VERP/MAPD90)增大，可减少期前收缩的发生，并使折返激动易被阻断，有抗心律失常效应；反之，VERP/MAPD90减小时，则易发生心律失常。
本实验结果表明：心梗后抑郁大鼠心室肌较正常组、心梗组和抑郁组MAPD90和VERP均有延长，VERP/MAPD90则降低，抑郁和心梗对大鼠心室肌电生理特性的影响可能存在累积效应。VERP/MAPD90的降低可能导致心肌电生理特性的不稳定，早期后除极的发生增加，室性心律失常易于诱发，而其室颤阈值较正常组降低也说明了这一点。舍曲林干预可缩短模型组的VERP，并使VERP/MAPD90增大，室颤阈值增加。这进一步说明，心室肌电生理特性的改变可能是心梗后抑郁增加恶性心律失常发生，导致心脏性猝死，增加死亡率的原因之一。
抑郁对心脏电生理特性产生影响的具体分子机制尚不清楚，可能通过以下途径发挥作用：①抑郁患者自主神经功能紊乱，交感神经系统激活导致静息心率增高，心率反应性增高，压力反射敏感性受损，心室复极高变异性，心率变异性降低。交感神经系统激活，心肌局部儿茶酚胺增多，通过β受体途径，激活L型钙通道，使细胞内钙离子浓度升高，钙离子过多堆积，引起相应离子通道表达的改变，从而影响离子流的幅度和时程，进而影响心室肌细胞复极异常。②抑郁引起HPA轴活性增高，血浆皮质醇浓度增高，从而影响L型钙通道、钠钙交换体和瞬时外向钾通道蛋白等的功能和表达，影响心肌复极，延长ERP。③抑郁引起免疫状态异常，IL-1、IL-2、IL-6等细胞因子水平升高，从而影响离子通道蛋白的表达和功能，影响心肌复极，延长ERP。
舍曲林的抗抑郁治疗可能通过增加患者的迷走神经张力、降低交感神经活性而增加心率变异性，改善心脏的自主神经功能。舍曲林的作用靶点5-HT能神经元参与了心血管系统的调节，对维持基础心血管功能及心血管反射功能起重要作用。
(2) 心肌Kv4.2通道表达变化：钾通道在调节细胞膜电位、细胞兴奋性及肌肉组织收缩舒张活动中具有重要作用。钾通道按其电生理特性分为电压依赖性钾通道、钙依赖性钾通道和内向整流钾通道，其中电压依赖性钾通道(Kv)又可分为延迟整流钾通道(delayed rectifier potassium current，Kr)和瞬时外向钾通道(KA)。KA通道激活迅速，失活快，但活性恢复缓慢。该通道在细胞膜去极化明显时才被激活，其产生的外向电流Ito无整流性，参与动作电位1期复极过程。Kv4.2通道是构成瞬时外向钾电流(Ito)的重要离子通道蛋白，介导心脏动作电位的早期复极化阶段。心肌缺血时，由于缺血缺氧心肌局部代谢产物堆积，引起微环境发生变化，如pH减小等，而Kv4.2通道在缺血缺氧等改变时表达量及功能发生变化，离子流明显受到抑制。研究发现，心肌缺血缺氧可以使犬类心室肌细胞Ito下调；将细胞外液pH下调后，Ito值也显著下调。而细胞微环境恢复正常后，Ito可部分纠正。说明心梗后心肌细胞缺血缺氧导致微环境变化是Ito下调的原因之一，是心梗后心律失常发生的重要机制。
Kv4.2表达下降使Ito电流密度减低，细胞内钾外流减少，使动作电位时程(action potential duration，APD)延长，复极时间相对延长，容易引起传导阻滞，形成折返，诱发早期后除极(early afterdepolarization，EAD)，而心室肌不同部位APD不同，Ito减低所致APD延长亦不同，导致心室复极时程及顺序异常，易形成折返，引起室性心律失常的发生，如心率变异性(HRV)降低，室颤阈值(VFT)降低，导致心脏性猝死的发生。本研究检测了心室肌瞬时外向钾通道(Kv4.2)的表达，结果表明：心梗组、抑郁组和模型组Kv4.2表达均较正常组减少，而舍曲林可使其表达增加。Kv4.2表达量的异常可能是抑郁易导致心律失常的机制之一。
Ren等研究发现心梗修复期心脏NMDA受体表达升高，添加NMDA激活心肌细胞的NMDA受体，使Ca2+内流增加，Ca2+通过一系列信号通路阻止了核内表达Kv交互作用蛋白(KChIPs)的序列，使KChIPs表达减少，最终Kv4.2在心肌细胞膜上表达减少，导致Ito电流密度减低，复极时间相对延长，这可能是心梗后室性心律失常发生的重要机制之一。KChIPs是调节Kv4.2在细胞膜上表达和功能的蛋白质，其缺乏会阻碍Kv4.2通道在细胞膜上定位，导致Ito的电流密度降低，APD及ERP延长，因此可通过折返机制诱发心律失常。
(3) 心肌L型钙通道表达变化：心肌细胞膜上存在L型和T型两种电流特性不同的钙通道。T型钙通道不影响动作电位的形成，而L型钙通道是Ca2+进入心肌细胞内的主要通道，L型钙通道电流(ICa-L)主要在快速去极化时引起电位的传播，参与动作电位2期(平台期)的形成，构成窦房结和房室结的动作电位。Ca2+可经L型钙通道进入胞质内，并触发肌质网的Ca2+的大量释放，引起细胞内Ca2+浓度的迅速增加，在心室肌动作电位的形成及兴奋收缩耦联中起重要作用。构成心肌细胞L型钙通道电流的重要亚单位有α1C、β2、α2/δ，产生功能钙通道分子的亚单位是α1C亚单位。我们的实验发现，模型组心室肌α1C亚基表达量较正常组增加了(95±29)%，舍曲林的干预则可使心梗后抑郁大鼠心室肌α1C亚基的表达量减少(19±7)%。
α1C亚基表达的升高可以影响L型钙通道的功能，导致Ca2+内流增加，而Ca2+内流的增加和细胞内Ca2+浓度的升高可以导致心律失常和心肌细胞的损伤。此外，Ca2+可与钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合形成Ca2+/CaM复合物，激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)，作用于ryanodine受体(RyR)而触发钙离子从肌质网释放，进一步加重了细胞内钙超载。同时，CaMKⅡ在过度激活时可通过增加LTCC的再开放，拮抗钾离子通道，增加ICa-L，减少Ito，从而触发心律失常，易于导致早期后除极(EAD)和尖端扭转型室性心动过速(TdP)。Ca2+/CaM拮抗剂W-7和CaMKⅡ特异性*制剂抑**KN-93的使用均可减少早期后除极和晚期后除极，并明显减少室性心律失常的发生。另有研究表明，CaMKⅡ在心肌肥厚、心肌细胞凋亡及心力衰竭等的发生过程中亦有重要作用，过度的CaMKⅡ活化会导致细胞凋亡，表现为心肌肥大并伴有显著的心室壁变薄，促进心力衰竭发生。而CaMKⅡ特异性*制剂抑**KN-93可抑制CaMKⅡ的表达和活性，显著改善心脏结构变化和血流动力学，起到保护心脏的作用。
同时CaMKⅡ也是脑内含量最丰富的蛋白激酶，高表达于海马和大脑皮层的突触后致密物质(postsynaptic density，PSD)中，而海马和大脑皮层是学习记忆和行为的结构基础，研究表明，CaMKⅡ 是学习与记忆的分子基础。另外，CaMKⅡ在中枢神经可塑性及多种认知活动中均有重要作用，被称为“记忆分子”。创伤、大脑缺血、间断低氧等多种刺激及慢性应激将导致Ca2+/CaM表达的动态变化，进而影响CaMKⅡ活化，引起细胞凋亡及神经可塑性降低。而CaMKⅡ特异性*制剂抑**KN-93可减少CaMKⅡ活化，起到神经元保护作用。钙调蛋白通路变化参与了创伤后应激障碍行为异常的发生。而中枢内CaMKⅡ可被NMDA受体所激活。综上所述，Ca2+/CaM/CaMKⅡ通路可能是心脏心理共病发病机制中关键信号通路之一。
4. 研究的局限及展望 本研究从动物水平、蛋白水平较深入地探讨了心梗后抑郁可能的发病机制，但仍存在以下局限：①本研究中，五组实验动物中仅模型组进行了舍曲林的处理，而正常组未予舍曲林。因此，舍曲林是否会对正常组、心梗组及抑郁组的行为和电生理特性产生影响？还是仅对心梗后抑郁大鼠起作用？这一问题也是我们未来的研究方向之一。②由于心脏电生理指标是在麻醉开胸状态下检测的，不能排除麻醉对指标可能产生的影响。③由于大鼠心肌厚度和实验操作中的局限，本研究仅测定了大鼠心脏外膜的电生理指标，只能证明心室肌外膜的电生理改变。由于离子通道存在跨壁的不均匀分布及电异质性，本研究尚无法证明心梗后抑郁对心室肌内膜及中层心膜的电生理特性有相同的影响，有待进一步研究证实。④关于心肌离子通道，本研究中仅分析了Kv4.2和L型钙通道蛋白的表达，此外还有钠钙交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)等多种离子通道与心律失常的发生相关，本研究对于心梗后抑郁对心脏电生理的影响机制的阐述尚不够完全。
在未来的研究中，我们还将运用生理信号无线遥测植入子对大鼠进行清醒状态下24 h心电监测，对比记录各组大鼠心率变异性、心律失常发生率等，排除手术操作对电生理结果的影响，直接、客观地反映心梗后抑郁对心律失常发生的影响；通过膜片钳方法检测心室肌膜通道蛋白功能的改变。此外，我们还将以NMDA受体为靶点，开展一系列研究，在心脏和海马中同步检测其下游信号通路活性的变化，包括Ca2+/CaM/CaMKⅡ通路、CREB通路、Ras/ERK通路等，并探讨舍曲林对心血管系统的影响是否与其抗抑郁作用相关，进一步阐述心脏心理共病的发病机制。
五、结论
(1) 经4周造模后，抑郁组和模型组大鼠表现出明显的抑郁样行为，Western Blot结果显示海马NR1 亚基表达下降。舍曲林干预后，模型大鼠的抑郁样行为得到改善，同时海马NR1亚基表达上调，表明舍曲林可能通过调节海马NR1表达从而改善动物的抑郁样行为。海马NR1表达异常可能是心梗后抑郁发生的机制之一。
(2) 心梗后抑郁大鼠心室肌较正常组、心梗组和抑郁组MAPD90和VERP均有延长，VERP/MAPD90则降低，抑郁和心梗对大鼠心室肌电生理特性的影响可能存在累积效应；舍曲林干预可明显提高心梗后抑郁大鼠的室颤阈值。结合蛋白检测结果，我们推断，抑郁可能通过下调Kv4.2、增加L型钙通道的表达而影响心脏电生理，增加患者的心律失常发生率；而舍曲林干预可能通过部分逆转上述变化，从而减少心梗后抑郁患者恶性心律失常的发生率，提高生存率。心肌离子通道表达异常可能是抑郁对心脏电生理影响的分子机制之一。
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