菠萝蜜果实采收时富含淀粉,在其成熟过程中,果肉淀粉迅速降解是果实质地快速软化和风味品质形成的关键。
为了让菠萝蜜保存更长的时间,我们将使用1-MCP处理菠萝蜜,然后研究果肉细胞显微结构的变化、果实品质、AMY活性、BAM 活性和淀粉降解,找出最合适的浓度。

1-MCP对菠萝蜜果实TSS含量的影响
TSS是评价果实风味品质的重要指标,不同处理菠萝蜜果实的 TSS 含量和硬度如图所示,不同处理菠萝蜜果实的 TSS 含量变化均呈现先升后降的变化规律,正常存放的菠萝蜜在采收后 TSS 含量急速上升,至第4d达到峰值20.44+0.30%后开始下降;ETH 处理果实的TSS含量在处理后 2.5 d升至最高18.5+0.19%,相比正常后熟的果实提前了TSS含量出现高峰,峰值降低了10.5%;1-MCP 处理的TSS含量在处理后前8d缓慢上升,之后上升速度加快,第 11d达到峰值 18.38±0.44%,TSS 含量与 ETH 处理相近,相比正常后熟果实TSS含量出峰时间延迟了7 d。
果实硬度是衡量菠萝蜜果实后熟程度的重要标准,正常后熟的菠萝蜜果实前2d硬度变化较小,第 3-4d果实快速软化,之后4d果实软化速率减缓;ETH处理加速了果实的软化,并提高了果肉软化速率,处理后果肉迅速软化,第3d果肉硬度已接近最低值:1-MCP处理降低了果实软化速率,前8d果实硬度仅降低4%,之后开始加速软化,12d后果肉硬度降至4.68kg。

菠萝蜜果实采收时果肉富含淀粉,采后不同处理菠萝蜜果肉中支链淀粉和直链淀粉含量变化如图 3-5 所示。刚采摘的菠萝蜜果肉中总淀粉含量高达 159.4mg/g,支链淀粉含量为117.2 mgg。正常后熟过程中,菠萝蜜果肉体内支链淀粉的降解主要集中在采后前 4d,降解量占总量的 95.1% 处理加速了果肉中支链淀粉降解,第1d降解量达85%,后2d降解速度随时间推移逐渐降低; 1-MCP处理很大程度上延缓了支链淀粉降解,处理后前8d降解速度缓慢,降解量很少之后降解速度加快,直至处理后第12d基本降解完全。
刚采摘的菠萝蜜果肉直链淀粉较低仅 43.51 mg/g,在采摘后迅速下降,于第4d几乎完全降解(含量):ETH 处理后,加快了直链淀粉的降解速度,降解曲线更陡峭,于处理后25d基本降解完全,较对照组提前了15 d:1-MCP处理组的果实,前8d直链淀粉降解速度较慢,之后降解速率加快,直至第13d完全降解,相比对照组推迟了9d。

1-MCP对菠萝蜜果实AMY和BAM活性分析
菠萝蜜果实成熟过程中的 AMY 活性变化比较剧烈,采后其活性迅速上升,在第3d达到峰值(峰值数值 4.63 U/g·FW)后迅速下降;ETH处理促进了 AMY 活性高峰的提前,但降低了 AMY 活性,并在处理后第 1-3 d保持较高的活性;1-MCP 处理延迟了 AMY 活性高峰的到来,降低了 AMY 活性(降低了 17.3%),并在处理后第 8-11 d保持较高的 AMY 活性。
BAM 是一种外切酶,可从淀粉的非还原性末端专一性水解a-1.4-糖苷键,在支链淀粉和直链淀粉的降解过程中起着关键作用。不同处理对 BAM 活性的影响如图 3-6 所示。正常后熟菠萝蜜果实成熟期间的 BAM 活性增长较快,在采后第3 d达到峰值后稍有下降,但仍能保持较高活性;ETH处理 BAM 活性在贮藏期间总体保持上升趋势,于采后第3d达到最大 14.20+0.12 U/g TW,提高了 10.6%;1-MCP 处理果的 BAM 活性在采后4d开始快速提升,第 10d达到最大值后开始下降,延缓了 BAM 活性出峰时间,但提高了峰值 19.9%。

采用岛津液相色谱仪对菠萝蜜果实中的糖分含量进行测定,测定标样20mgg 混合标样各糖分出峰时间如图 3-7 所示,葡萄糖、果糖、蔗糖出峰时间分别为11.113 min、12.907min、19.539 min,各峰之间分离比较完全,峰边缘较为平滑,可用于糖分含量正常测定。各类糖分测定所需标准曲线如表 3-1,R²均在0.9999以上,说明相关性较好,可用于各糖分含量计算。

正常后熟果实蔗糖含量前3d增长迅速,第4d达到最高113.86+6.81 mg/g,后2d蔗糖含量缓缓下降;ETH 处理后果实的蔗糖含量迅速增加,于第 1.5d后达到 107.87+0.20 mg/g,随后缓慢增加,2.5d后有所下降;1-MCP处理的蔗糖含量前8d增长缓慢,仅为21.20 ±1.00 mg/g,第 8-11 d蔗糖含量快速增长至最高值 101.75+5.75 mg/g,较CK 降低 10.64%,后 2d蔗糖含量降低,降幅达 72.41%。
CK、ETH、1-MCP 处理蔗糖含量在贮藏期内均呈上升趋势,CK第2-4d上升速度最快,增长量占总量 72.29%,ETH 处理 0.5d后,果糖含量增长较快,直至果实完全成熟:1-MCP 处理前9d果糖含量基本无增长,之后含量不断增加,且在第11d后增长加速,于第13d达到最高 41.93+0.73 mg/g,极显著高于ETH 与CK 处理。

正常后熟果实葡萄糖含量在第 2-4d葡萄糖含量快速增加,后2d增长速率有所降低,第6d达到最高值25.52+0.04 mg/g;ETH 处理 0.5d后,葡萄糖含量持续升高且上升速度较快,第3d升至最高 23.54+0.43 mg/g;1-MCP 处理后前9d葡萄糖含量极低,之后葡萄糖含量迅速上升,处理后第 13 d达最大值37.55+0.81 mg/g,远高于其他两种处理。
对AheBAM1/3/6/8 蛋白的糖基化位点进行预测发现,AheBAM1 蛋白有3个0-糖基化修饰的位点,分别位于该肽链第66、68、268氨基酸处: AheBAM3 蛋白有2个0-糖基化修饰的位点,位于第 9、215氨基酸处,AheBAM6 蛋白有3个0-糖基化修饰的位点,分别位于第22、68、231氨基酸处;AheBAM8 蛋白有1个0-糖基化修饰的位点,位于第62氨基酸处。

AheBAM1 蛋白有 56 个磷酸化修饰的位点,其中丝氨酸磷酸化修饰位点最多有30 个,苏氨酸的磷酸化位点为 13 个,而酪氨酸的磷酸化位点最少仅为 13 个;AheBAM3 蛋白有 65 个磷酸化修饰的位点,其中丝氨酸磷酸化修饰位点 45 个,苏氨酸的磷酸化位点 12 个,酪氨酸的磷酸化位点8个:AheBAM6 蛋白有 65 个磷酸化修饰的位点,丝氨酸磷酸化修饰位点 45 个,苏氨酸的磷酸化位点 12 个,酪氨酸的磷酸化位点8个:AheBAM8 蛋白有63个磷酸化修饰的位点,丝氨酸磷酸化修饰位点 32 个,苏氨酸的磷酸化位点 18 个,酪氨酸的磷酸化位点 13 个。

AheBAM1/3/6/8 蛋白的糖基化位点数量较少,大多处于各肽链前100个氨基酸以内,并且糖基化位点主要集中在丝氨酸上;AheBAM1编码蛋白的磷酸化位点较少为56个,AheBAM3/6/8 的磷酸化位点数量较多有 65个左右,AheBAM1/3/6/8 蛋白中,丝氨酸的磷酸化位点数量最多,苏氨酸磷酸化位点数量次之,酪氨酸的磷酸化位点最少。
对 AheBAM1/3/6/8 蛋白的二、三级结构和亚细胞定位进行预测,AheBAM1 蛋白的二级结构中含有 57.05%的无规则卷曲、14.09%的延伸链和 28.86%的a-螺旋,三级结构由 307 个氢键、22 个a-螺旋、50 个转角和 19 个β-折叠构成,且该蛋白被定位于蛋白被定位于细胞膜、细胞壁叶绿体、细胞质、线粒体中。
AheBAM3 蛋白的二级结构含有 57.38%的无规则卷曲、13.83%的延伸链和28.79%的a-螺旋,三级结构由 303 个氢键、21 个a-螺旋、49个转角和19个β-折叠构成,该蛋白被定位于叶绿体、细胞质和线粒体中。

AheBAM6 蛋白的二级结构含有 57.86%的无规则卷曲、13.93%的延伸链和28.21%的a-螺旋,三级结构由 312 个氢键、21个a-螺旋、51 个转角和 20 个β-折叠构成,且被定位于细胞壁、细胞核中。
AheBAM8 蛋白的二级结构含有 57.89%的无规则卷曲、12.05%的延伸链和30.09%的a-螺旋,三级结构由 301 个氢键、21 个a-螺旋、48 个转角和 20 个B-折叠构成,被定位于细胞核中。
AheBAM1/3/6/8 蛋白的二级结构都由无规则卷曲、延伸链和a-螺旋三种基本结构构成,且各蛋白中三种基本结构所占比例差别较小,AheBAM1/3/6/8 蛋白的三级结构中都含有一个典型的(B/a)s桶状核心。

结语
淀粉酶是多基因家族,在拟南芥*共中**有9个BAM 基因,被分为4个亚类认为BAM1 和 BAM3 是主要负责淀粉降解的β-淀粉酶基因!4。橡胶树的 BAM1基因cDNA 序列全长为 1913 bp,其中编码区长 1752 bp,共编码 583 个氨基酸序列,与拟南芥 HbBAM1 的氨基酸同源性为 75.7%"42]。香蕉 MaBmy3 基因的分子量为 64.5 KD,等电点为 5.11,脂溶系数为 78.43,总平均疏水指数为-0.307,被定位于细胞核;该蛋白二级结构由a-螺旋、扩展链结构、B-转角和无规则卷曲四种形式构成。
我们对AheBAMI/3/6/8 的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列做生物信息学分析,AheBAMI 编码区长 1791 bp,编码 596 个氨基酸,其分子量为 65.60KD等电点为 6.08,被定位于细胞膜、细胞壁、叶绿体、细胞质、线粒体中:AheBAM3编码区长1608 bp,编码536个氨基酸,分子量为47.24KD,等电点为 6.03,被定位于叶绿体、细胞质和线粒体中;AheBAM6 编码区长 1683 bp,编码 560 个氨基酸,其分子量为63.23 KD,等电点为 8.68 被定位于细胞壁、细胞核中;AheBAM8编码区长 2019 bp,编码 672个氨基酸,其分子量为 76.64KD,等电点为 5.85被定位于细胞核中。

菠萝蜜果实的硬度与支链淀粉和直链淀粉含量之间呈现极显著相关,与果糖、蔗糖和葡萄糖含量之间呈显著负相关,ETH与 1-MCP处理对其无影响,CK与ETH处理后B-淀粉酶活性与淀粉含量之间呈极显著相关1-MCP 处理降低了二者之间的相关性:β-淀粉酶对淀粉的相关性强于a-淀粉酶,认为B-淀粉酶对淀粉的降解作用强于α-淀粉酶。
CK 与 1-MCP 处理后AheAMYI/2/3 与AheBAM3 的表达之间呈显著相关,ETH 处理降低了它们之间的的相关性,CK与 ETH 处理后 AheAMYI/2/3 和AheBAM3 的表达与a-淀粉酶活性之间呈显著相关,1-MCP处理降低了它们之间的相关性。