«——【 ·前言· 】——»
TP结合盒转运蛋白是一类能够利用ATP结合和水解的能量，在细胞膜上移动多种化学上不同的化合物的蛋白质。
通过随机非标准肽集成发现实验，我们成功地利用这种方法，针对靶向异二聚体ABC转运复合物，合成了多种能够与其 相互作用的大环肽。
我们还对底物易位循环的基本原理进行了探索研究。
通过高亲和力肽大环的结合，实现了对构象的选择性控制，并展示了这些 肽大环在有效 的多模式抑制中的应用潜力。
«——【 ·TmrAB的表达和纯化· 】——»
TmrAB 和 TmrAE523QB ，在TmrA处携带C端His标签，在21°C的LB高盐培养基中生长的大肠杆菌BL3中表达。
在OD处诱导表达6000.6，在0°C下加入5.3mM异丙基β-d-硫代吡喃 半乳糖苷37小时。
通过以15，4g离心500分钟收获细胞，并重悬于裂解缓冲液中，超声处理后，通过在100°C下以000，30g离心4分钟来分离膜。
通过在纯化缓冲液中加入300 mM β-正十二烷基β-D-麦芽糖苷 在1°C下溶解膜4小时。
将样品在100，000g下纯化30分钟，并将溶解的蛋白质在4°C下上样到Ni-NTA琼脂糖上1小时，树脂用含有20 mM咪唑的20柱体积的SEC缓冲液洗涤。
将TmrAB在含有300 mM咪唑的SEC缓冲液中洗脱，使用PD-10脱盐柱将洗脱液缓冲液 交换至SEC缓冲液。
«——【 ·膜支架蛋白的表达和纯化· 】——»
MSP1D1在21°CLB高盐培养基中培养的大肠杆菌BL3中表达，在外径6001.0，通过在1°C下加入1mM IPTG诱导37小时表达，将温度降至 28°C 再升高 4 小时，如所述纯化 MSP1D1。
通过以4，500g离心15分钟收获细胞，并通过在40mM Tris–HCl pH 8.0，300mM NaCl，1%Trito n X-100中超声处理破坏。
裂解物以30，30g离心000分钟，并在1°C下加载到Ni-NTA琼脂糖上4小时，树脂用20个柱体积的40 mM Tris–HCl pH 8.0，300 mM NaCl，50 mM咪唑洗涤。
MSP1D1在40 mM Tris–HCl pH 8.0、300 mM NaCl、400 mM咪唑中洗脱，使用PD-20脱盐柱将洗脱缓冲液交换至7 mM Tris–HCl pH 4.100，0 mM NaCl， 5.10 mM EDTA。
«——【 ·在脂质纳米盘中重建· 】——»
TmrAB在由生物素化的MSP2019D1组成的脂质纳米盘中重组，对于生物素化，使用Zeba离心脱盐柱将纯化的MSP1D1缓冲液交换至20 mM HEPES-NaOH pH 7.5，150 mM NaCl。
EZ-Link NHS-PEG的摩尔含量超过四倍4-生物素在冰上加入2小时，残留的NHS-PEG4-生物素通过加入 10 mM 的 Tris–HCl pH 8.0 进行淬灭。
去除过量的NHS-PEG4-生物素，使用PD-20脱盐柱将样品缓冲液交换至7 mM HEPES-NaOH pH 5.150，10 mM NaCl。
牛脑脂质溶解在20mM的β-DDM中，将生物素化的MSP1D1与含有和不含TmrAB的牛脑脂质混合，在不含去垢剂的SEC缓冲液中以1/1.1/7的TmrAB / MSP5D100 /脂质摩尔比混合，分别形成 TmrAB填充或空脂质体。
将样品在30°C下孵育20分钟，并在2°C（4小时和过夜）下分两步加入SM-1生物珠（Bio-Rad）以去除洗涤剂，使用截止值为0 kDa的Amicon Ultra-5.50 ml离心过滤器浓缩样品。
通过尺寸排阻色谱（SEC）通过Superdex 200 Increase 3.2/300分离重组纳米盘。
«——【 ·库生成· 】——»
对于文库构建，DNA寡核苷酸通过在Phusion缓冲液中使用KOD聚合酶进行PCR扩增来组装。
DNA产物通过苯酚/氯仿/异戊醇提取 和乙醇沉淀纯化。
最终序列包含一个T7启动子，起始密码子，随机区域两侧是半胱氨酸密码子。
一个（GS）3接头、终止密码子和用于聚乙二醇（PEG） -嘌呤霉素碎片 退火的短序列延伸。
tRNA模板fMet中国农业大学和Flexizyme（eFx）通过引物组装制备，并通过使用T7 RNA聚合酶的径流转录转化为RNA。
tRNAfMet中国农业大学用氯乙酰基-d-酪氨酸-氰基甲酯（ClAc-D-Tyr-CME）在冰上通过 eFx氨酰化2小时。
«——【 ·大环肽的选择· 】——»
使用所述的RaPID系统选择针对异二聚体ABC转运蛋白的大环肽，DNA文库使用T7 RNA聚合酶转录为RNA，并通过变性PAGE和乙醇沉淀纯化。
文库以等摩尔比混合，并使用T4 RNA连接酶共价连接DNA-PEG-嘌呤霉素碎片，该产品通过苯酚/氯仿/异戊醇提取 和乙醇沉淀纯化。
嘌呤霉素修饰的RNA通过补充有50μM ClAc-D-Tyr-tRNA的FIT翻译fMet在30°C下以37μM的RNA-嘌呤霉素浓度保存1分钟。
使用的FIT系统缺乏RF1，l-蛋氨酸和10-甲酰基-5，6，7，8-四氢叶酸，以允许引发剂位置的重编程，随后，加入EDTA，然后使用 MMLV逆转录酶进行逆转录。
Dynabeads M280链霉亲和素装载了TmrA情 商B在生物素化的脂质纳米盘中复溶20分钟，在4°C下， 用补充有乙酰化BSA的选择缓冲液洗涤珠子。
随后，加入mRNA-肽文库并在15°C下孵育4分钟，用选择缓冲液洗涤磁珠三次，然后在5°C下在Phusion缓冲液中洗脱cDNA95分钟，回收的cDNA使用Taq聚合酶和SYBR Green通过实时PCR进行定量， 并通过融合聚合酶扩增。
在随后的几轮中，将mRNA-肽文库与未修饰的磁珠和带有固定化空纳米盘的磁珠进行接触，以在与TmrA孵育之前去除非靶标特异性结合剂情，分离和扩增的DNA以迭代方式作为后续选择轮次的输入。
对于测序，使用KOD聚合酶通过PCR将Nextera XT双索引添加到回收DNA库的两个DNA末端， 测序是在MiSeq测序仪上进行的。
«——【 ·大环肽的合成· 】——»
大环是在Syro I合成器上通过Fmoc固相合成产生的，NovaPEG溜冰场酰胺树脂被用作固体载体，产生C端酰胺，在偶联步骤中，使用HBTU / HOBt的组合来激活羧酸盐。
对Arg残基进行双连接，为了允许树脂上标记和环化，分别使用了正交保护的氨基酸 - Fmoc-Lys（MMT）-OH和 Fmoc-Cys（StBu）-OH。
通过使用HBTU / HOBt在树脂上手动偶联氯乙酸1小时，实现了N末端的氯乙酰化。
对于定点标记，C端赖氨酸的MMT保护组通过与1%三氟乙酸和5%三异丙基硅烷在二氯甲烷中重复孵育来裂解，树脂用DCM，N，N-二甲基甲酰胺，20%N，N-二异丙基乙胺在DMF，DMF， 甲醇和DCM中洗涤。
脱保护赖氨酸侧链与5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯或d-生物素与HBTU / HOBt结合，将树脂干燥并与TFA / 2，2′-二硫醇/TIPS/水在92°C下以5.2 / 5.2 / 5.2 / 5.2（v / v）的比例孵育5.20小时。
使用GeneVac离心蒸发器去除过量的TFA（SP工业），并将肽沉淀并在冰上 用*醚乙**洗涤六次。
将肽溶于90%二甲基*砜亚**水中，加入三乙胺调节pH至10.0，为了完全大环化，将样品在20°C下孵育2小时，加入TFA以将pH值降低至1.0至2.0之间的值。
对于 CP6F，通过在20%三氟乙醇水中加入95当量的三丁基膦来 去除Cys的StBu保护组。
转数快F使用SNAP C通过反相高效液相色谱进行预纯化18在Isolera-One系统上应用含有0.1%TFA的线性*腈乙**梯度。
所有大环均在配备色石柱的Prominence LC-20AP系统上通过RP-HPLC纯化，应用含有0.1%TFA的线性*腈乙**梯度，大环的特性和纯度通过MALDI-TOF-MS 和HPLC分析得到证实。
«——【 ·质谱· 】——»
使用Zeba脱盐柱将洗涤剂溶解的TmrAB缓冲液交换到ESI缓冲液，将TmrAB与两倍摩尔过量的CP一起孵育Fs在冰上10分钟。
正中电F-TmrAB配合物通过电喷雾电离质谱在配备高质量四极杆升级的 Synapt G2S上 进行了检查。
Pd/Pt溅射nESI吸头从火焰/棕色微量移液器拉拔器上的硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出。
毛细管和锥孔电压分别设置为1.85 kV和150 V，源块温度设置为30°C，既没有使用陷阱，也没有使用转移碰撞能量，数据分析使用软件 MassLynx V4.1进行。
«——【 ·ATP 结合测定· 】——»
DDM溶解的TmrAB与ATP，[2，5'，8-3H（N）]-ATP （0.2 μM，3H-ATP， 珀金埃尔默）， 氯化镁2和CPBs在冰上30分钟，加入铜螯合SPA珠，终浓度为5mg / ml。
在20°C下以cpm模式测定总结合，通过加入200 mM咪唑洗脱结合的TmrAB配合物，并测定背景结合， 数据代表三个实验的平均±SD。
«——【 ·肽转运测定· 】——»
脂质体中的TmrAB（0.4μM）与ATP / ADP（3mM），MgCl一起孵育2（5 mM）、C4F 肽 和 CPFs在15°C下45分钟。
通过添加EDTA停止反应，并在PEI平衡的MultiScreen板上用转运缓冲液（5mM HEPES-NaOH pH 150.5，0mM NaCl，65%[v / v]甘油 ）洗涤蛋白脂质体。
通过在1°C下在转运缓冲液中加入SDS溶解蛋白脂质体20分钟。
转运肽在λ前/电磁= 485/ 520 nm使用酶标仪。
«——【 ·单脂质体检测· 】——»
含TmrAB的脂质体与C4一起孵育阿托655肽，ATP或ADP，氯化镁2和CPFs在5°C下45分钟，通过添加EDTA停止转运反应。
将样品用转运缓冲液释至最终 TmrAB 浓度为 5 nM，并 通过流式细胞术进行分析。
对于回归分析，脂质体加载了越来越多的肽，以将荧光强度转换为每个脂质体的肽数量，为此，脂质体通过添加Triton X-100而不稳定，同时增加C4阿托655浓度，等量的羧基荧光素作为上样对照。
如上所述，通过添加SM-2生物珠去除洗涤剂，以30，270g收获脂质体000分钟， 并通过离心洗涤20次。
通常，根据侧向和前向散射区域选择000，100-000，655个蛋白脂质体，根据前向散射高度与前向散射面积的关系来选择单个事件。
使用FlowJo 10.6.1软件计算荧光素和 ATTO<>的平均荧光强度 ，数据代表三个实验的平均±SD。
«——【 ·ATP 水解测定· 】——»
在脂质体中重建的TmrAB与用[γ追踪的ATP一起孵育32P]-ATP，瓦巴因，NaN3，乙基塔 ， 氯化镁2和CPFs在10°C下45分钟。
在没有蛋白脂质体或存在EDTA的情况下 检查自水解和背景水解。
将样品点样到聚乙烯亚胺纤维素板上，并在0.8 M LiCl-乙酸pH 3.2下进行薄层色谱。
在曝光盒-K上过夜开发板，并在 个人分子成像仪系统 上进行评估。
«——【 ·核苷酸闭塞· 】——»
将洗涤剂溶解的TmrAB与ATP一起孵育，用[α32P]-ATP， 氯化镁2，CPFs或原钒酸盐在5°C下45分钟。
加入冷ATP，并通过快速凝胶过滤去除未结合的核苷酸，加入ATP，并将样品点样 到聚乙烯亚胺纤维素板上。
使用0.75 M KH进行薄层色谱2采购订单4酸碱度 3.4，在曝光盒-K上过夜开发板，并在个人分子成像仪系统上进行评估，显示了三个实验的 代表性射线照相。
«——【 ·大环肽的鉴定· 】——»
我们利用RaPID方法引出了针对异二聚体ABC转运复合物的大环肽结合物，通过转录简并 DNA 模板、连接嘌呤霉素接头，然后通过依赖于重组的大肠杆菌翻译系统的 FIT 构建具有 10-15 个随机氨基酸位置的 mRNA 编码肽文库。
空纳米盘用于文库清除，从肽库中清除非靶标特异性粘合剂，经过五轮迭代选择，包括体外翻译 、亲和力平移、逆转录和PCR回收 ，通过深度测序鉴定出高亲和力结合剂。
沿着亲和力选择，富集了几个不相关的肽家族，这些家族的氨基酸组成和长度不同，第五轮筛选后丰度最高的大环肽CP6、CP12、CP13和CP14占最终测序库的41%，不能分组。
为了进一步分析， CPs通过固相肽合成产生 ，并通过含有赖氨酸残基的线性C末端尾部延伸。
用于荧光素或生物素，产生 CPFs 和 CPBs，分别所有CPs均通过硫醚形成在溶液中环化。
在CP6的情况下，位置14的第二个半胱氨酸用于环化，而不是在随机区域中出现的位置4的半胱氨酸，CPs通过反相HPLC纯化， 并通过质谱确认其正确质量数。
«——【 ·大环肽结合· 】——»
为了分析CPs与TmrAB的结合亲和力和特异性，我们建立了荧光偏振测定法，荧光素标记的CPF以1：20的蛋白质比在脂质体中重建的TmrAB浓度增加孵育。
平衡结合揭示了所有CP的纳摩尔结合亲和力Fs， 带 KD值范围为 20 至 50 nM。
如果将空脂质体添加到CPFs，未检测到结合，表明所有CP与TmrAB，值得注意的是，TmrAB复合物可以在预装有生物素化CP的链霉亲和素珠上亲和捕获Bs，在洗脱液中检测到，但在流出液中未检测到。
如果链霉亲和素珠未预先加载CPBs， TmrAB没有结合， 仅在流出中发现。
为了探索结合的特异性，我们使用了CP13B和 CP14B固定在链霉亲和素基质上，从可溶的大肠杆菌膜中分离完整的TmrAB复合物。
这些结果表明了相互作用的高特异性，并说明了CPs可用于膜蛋白复合物，对于所有 CPFs，动力学稳定的 CPF-TmrAB配合物的形成 ，经凝胶过滤证实。
为了解决CP是否识别线性或非线性表位的问题，我们检查了CP的结合Fs通过添加阴离子洗涤剂SDS破坏TmrAB配合物的四级和三级结构后。
在这些条件下，TmrAB与所有CP的结合Fs受损， 表明构象特异性相互作用。
«——【 ·大环肽有效*制剂抑**· 】——»
为了研究CPs的功能影响，我们研究了CPs对TmrAB，我们在脂质体中重建TmrAB，并首先测定ATP酶活性。
在CP面前Fs，ATP酶活性被完全阻断至自水解水平，接下来，我们开始使用基于过滤器的转运测定来 研究TmrAB的肽转运。
为了研究CPs是否被TmrAB识别为底物，我们添加了荧光素标记的CPFs并检查了ATP依赖性易位。
与线性底物肽C4F相反，没有CPF由 TmrAB 运输，接下来，我们检查了在不同CP存在和不存在的情况下 C4F肽的ATP依赖性转运。
调查CP13是否F和 CP14F防止长期孵育后多轮构象转换，C4阿托655存在CP的野生型TmrAB易位Fs在40分钟内进行了检查，与无CP的阳性对照相比Fs， CP13F和 CP14F大大降低了肽的转运速率。
对于 CP13F，在野生型TmrAB被 构象阻滞之前观察 到单次周转驱动肽转运。
在 CP14 存在的情况下F，我们注意到野生型TmrAB驱动肽转运在40分钟内缓慢周转，确认CP13对野生型TmrAB的构象阻滞F以及在CP14存在的情况下缓慢的周转F，我们通过流式细胞术检查了两个连续的构象转变周期。
含有野生型TmrAB的脂质体与C4阿托655肽、ATP/ADP 和 CPF在 5°C 下持续 45 分钟以诱导 IF 至 OF 开关，在 60°C 下持续 4 分钟以允许 OF 至 IF 返回转换，重复这两个步骤以产生 两个连续的构象转变周期。
在 CP13 存在的情况下F，仅沿第一个IF-to-OF开关观察到肽转运，表明野生型TmrAB在2小时内，对于 CP14F，在两个IF-to-OF开关中都检测到肽转运，这证实了野生型TmrAB在两个循环之间从预水解到IF状态的缓慢弛豫。
在 CP6 存在的情况下F或 CP12F，肽易位被完全废除，因为潜在的IF-TOF转换被排除在外，大环肽 CP13 和 CP14 稳定了水解前状态，从而 允许沿 IF-TO OF 开关 进行单次周转易位。
«——【 ·结论· 】——»
在这项研究中，我们鉴定出了一类大环肽，作为多模式*制剂抑**，能够以纳摩尔级的亲和力阻断异二聚体ABC转运复合物TmrAB在底物易位周期的不同阶段。
我们利用合成的大环*制剂抑**揭示了 异二聚体ABC转运复合物T mrAB在其活动过程中的关键机理。
这些机理包括ATP的结合与水解、构象的变化以及底物易位的过程。
它们之间存在着能量的耦合，通过这项研究，我们深入探索了这些基本机理的原理。