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二甲双胍能通过重塑肠道微生物群来缓解HIRI诱导的铁反应，并且已经在粪便微生物群移植（FMT）治疗的结果中得到了验证，但其基本机制仍不清楚，在目前的临床治疗中效果也并不理想。
本研究中，我们将采用了16S rRNA和宏基因组测序技术，主要为了监测二甲双胍在治疗中，肠道微生物的 GABA 合成关键酶谷氨酸脱羧酶（GAD）和腐胺转移酶（PAT）是否有增加。
实验最终的目的是为了揭示二甲双胍能够促使微生物对 HIRI 诱导的铁反应产生GABA，以此进一步的确认重塑肠道微生物群可以缓解 HIRI 诱导的铁中毒。
我们确信，二甲双胍能通过重塑微生物群和促使GABA产生，从而对抗HIRI并改善肝健康，尽管目前治疗HIRI的方法有限，但调节肠道微生物群将会是一种新的治疗策略。
一、多维技术研究肝脏结构与功能
准备6-8周龄无特定病原体雄性C57BL/6小鼠均被饲养在受控的温度和湿度条件下，光照-黑暗周期为 12 小时，并且可以自由获取食物和水，实验前禁食过夜。
术前用戊巴比妥钠麻醉小鼠，将无创微血管动脉夹置于肝动脉和门静脉左分支上30 min，取出夹子再灌注6 h，使用加热灯将体温维持在37°C，将小鼠随机分为几组。
一般来说，头侧叶的动脉和门脉血管夹闭30分钟，再灌注6小时，假手术对照小鼠中没有血管闭塞，动物接受二甲双胍（1 mg/mL）、二甲双胍改良粪便微生物群移植或二甲双胍（1 mg/mL）与抗生素（1 mg/mL 硫酸青霉素、1 mg/mL 硫酸新霉素、1 mg/mL 硫酸新霉素）混合治疗 /mL甲硝唑和0.16mg/mL庆大霉素）稀释在饮用水中，持续1周。
其他两组小鼠在肝缺血发生前1小时注射单剂量的去铁胺（DFO）（20 mg/kg ip）或GABA（100 mg/kg ip），溶解在PBS中，再灌注后处死小鼠，收集肝脏和血清样本进行分析。
1.1测量肝组织脂质过氧化、谷胱甘肽（GSH）和超氧阴离子水平
我们采用丙二醛（MDA）检测试剂盒测定，选择MDA水平作为脂质过氧化的标志物，根据制造商的说明进行测定，通过 BODIPY 581/591 C11 (MKbio, 217075-36-0) 测量脂质活性氧 (ROS)。
切片选择使用 BODIPY 581/591 C11 染色，并用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)成核，图像是在荧光显微镜下采集的，将肝脏匀浆，收集上清液，使用GSH测定试剂盒进行GSH分析。
随后将肝脏冰冻切片（8Lμm）置于载玻片上，并与 10Lmmol/L 二氢乙锭（DHE）在黑暗容器中37°C 30Lmin，将切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗三次，然后使用正置显微镜观察。
1.2H&E和PAS染色技术"组织免疫荧光染色
为了进行组织病理学检查，将肝脏和肠组织在4%多聚甲醛中固定过夜，选定的组织块在组织处理机中使用常规过夜循环进行处理，然后将组织块包埋在蜡中并连续切成 5 μm 的切片，即可在光学显微镜下获得可视化和图像。
免疫荧光期间，切片用一抗 (1:100) Occludin (Proteintech, 27260-1-AP) 和 zonula occlusionns 1 (ZO-1) (Proteintech, 66378-1-IG) 染色，并在 4°C 下孵育过夜。
与 Alexa Fluor 488（Bioss，bs-40296G-AF488）偶联的二抗在 37°C 下孵育 1 小时，额外的 PBS 清洗后，用含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的抗荧光猝灭剂密封切片，使用激光扫描共聚焦显微镜获得免疫荧光图像，并通过 ImageJ进行定量。
1.3透射电子显微镜 (TEM) 分析实时定量 PCR (qRT-PCR)
将灌注后对小鼠实施安乐死，切除肝脏并用预冷的PBS（pH 7.4）清洗，然后取出部分肝脏并在含有 2.5% 戊二醛的 0.1LM PBS (pH 7.4) 中孵育过夜，使用振动切片机将目标组织切成 50 µm 厚的切片。
选定肝脏区域后在 1% 四氧化锇中后固定 1Lh，在分级乙醇系列中脱水并包埋在环氧树脂中聚合在80L℃下进行24Lh切割超薄切片（100Lnm），用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在 JEM2000EX TEM下观察，每个样本随机选择五个视野来检查具有铁死亡特征的线粒体。
随后使用TRIzol从肝脏和肠组织中提取总RNA，使用试剂盒（Vazyme，R323-01）将分离的RNA逆转录为cDNA，使用设计用于检测白细胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-18、重组溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、溶质载体家族39成员14（SLC39A14）的引物对获得的cDNA进行PCR 、酰基辅酶 A 合成酶长链 4 (ACSL4)、环氧合酶-2 ( COX-2) ZO-1、Occludin、Claudin-1、连接粘附分子 (JAM)1、JAM4 琥珀酸半醛脱氢酶 (SSADH)、GABA转氨酶（GABA-T）、Gad1和Gad2以及β-肌动蛋白。
最后用 SYBR Green 试剂盒测定基因表达和循环仪 Dice 实时系统将所有结果针对 β-肌动蛋白表达进行标准化。
二、高效液相色谱串联质谱检测 (HPLC-MS/MS)
我们使用 ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱进行样品分离，进样量为 5 μL，二甲双胍检测条件如下：柱温30℃，流动相一NaH 2 PO 4（Sigma，V900060）含有 5 mmol/L 十二烷基磺酸钠（Sigma，V900859），pH 3.5，而另一个流动相是*腈乙**（Aladdin，A104440）。
通过HPLC测定每个样品中的二甲双胍含量，氨基酸检测条件如下：柱温40℃，流动相A为10%甲醇/水（含0.1%甲酸），流动相B为50%甲醇/水（含0.1%甲酸），流量速率为 0.4 毫升/分钟。
随后使用三重四极杆质谱仪和负电离模式下的 ESI 源进行质谱分析，使用高纯氮气作为雾化和干燥气体，在多反应监测模式下进行定量。
而16S rRNA 扩增子测序则在 Chunlab Inc.使用 MiSeq 系统 (Illumina) 进行，为了制备 MiSeq 文库扩增子，使用 ABI GeneAmp 9700 PCR 使用 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 引物扩增靶基因（16S rRNA V3–V4 区域）热循环仪。
随后将PCR 产物从 2% 琼脂糖凝胶中提取，使用 AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒，根据研究要求进行纯化，并使用 Quantus 荧光计进行定量，通过除以样本中所有 OTU 的总数，然后乘以得到表达的相对丰度，对样本中各个 OTU 的计数进行归一化。
从 16S rRNA 测序中提到的人类粪便样本中提取总基因组 DNA，DNA 提取物用 Covaris M220破碎成平均大小约为 400 bp 的片段，使用 NEXTflexTM Rapid DNA-Seq （Bioo Scientific, Austin, TX, USA）构建成对端文库，含有全套测序引物杂交位点的适配器被连接到片段的钝末端。
三、二甲双胍显着减轻 HIRI 并重塑小鼠肠道微生物群
为了评估二甲双胍对 HIRI 的保护作用，我们采用了小鼠存活实验，二甲双胍干预后，HIRI小鼠的存活率从41.67%提高到90.00%，同时肝脏形态学和组织病理学得到改善，包括肝脏病理结构恢复、红细胞聚集和肝糖原消耗减少，以及血清ALT和AST活性降低。
但在对小鼠肝脏中 MDA 和 GSH 浓度的鉴定表明，二甲双胍的存在明显减轻了 HIRI 诱导的氧化作用。
我们采集了小鼠粪便样本进行 16S rRNA 测序，结果发现，IR + 二甲双胍（Met）组小鼠的肠道微生物群发生了很大变化，丰度（α多样性）下降，分布也发生了改变。
而接下来正如微生物群-肠道-肝脏轴理论所指出的，HIRI 引起的肠道屏障功能障碍可能会通过破坏肠道微生物群而加重肝损伤，对主要涉及肠道屏障功能障碍的结肠和回肠进行的 H&E 染色显示，肠道粘膜的密度和完整性因 HIRI 而显著降低，而二甲双胍治疗后可恢复。
对结肠组织的免疫荧光分析表明，二甲双胍可逆转 HIRI 治疗小鼠体内紧密连接蛋白 ZO-1 和 Occludin 的减少，同样，二甲双胍也可增加结肠中 Occludin和 HIRI 小鼠回肠中 Occludin、ZO-1、Claudin-1、JAM1 和 JAM4 的 mRNA 。
而炎性细胞因子IL-6、IL-1β和IL-18在HIRI小鼠回肠和结肠中明显上调，二甲双胍治疗可降低其上调幅度，并且二甲双胍还能降低IR组血清FD-4的水平，由此证明二甲双胍在恢复肠道屏障功能和缓解 HIRI 方面起着作用。
四、二甲双胍形成的粪便微生物区系可减轻 HIRI
为了进一步证实二甲双胍在重塑肠道微生物群方面的作用，在诱导灌注（IR）之前将微生物移植到小鼠体内，不出所料IR + 粪便微生物群移植（FMT）组小鼠的存活率分析表明，IR + 二甲双胍组小鼠的存活率显著提高，与 IR + 二甲双胍组小鼠具有相似的保护功效。
在ALT和AST水平以及H&E、PAS和DHE染色也验证了这一发现，FMT 治疗可恢复 GSH 水平，但会减少肝组织中 MDA 的积累，FMT 组与 IR + Met 组相似，观察到α多样性减少。
同时，H&E染色显示肠道损伤减轻，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin改善，HIRI诱导的IL-1β、IL-6和IL-18减少，IR+FMT组血清FD-4水平急剧下降，为了进一步确定肠道微生物的功能，我们采用了抗生素和二甲双胍联合治疗。
不出所料，IR + 二甲双胍 + 抗生素（Abx）组的存活率大大降低，而 ALT、AST、MAD 和 GSH 的水平则与 IR + 二甲双胍组完全相反，证实肠道微生物群的重塑对二甲双胍抗 HIRI 的效果至关重要。
五、二甲双胍诱导产生 GABA 的肠道微生物群
我们在肝组织转录组的分析中表明，Met组与FMT组之间相似的mRNA变化主要集中在脂质代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢这三大通路上，鉴于脂质代谢与高铁血症之间的密切关系以及碳水化合物代谢是氨基酸代谢的主要途径，我们利用 HPLC-MS/MS 在肝组织中检测了 22 种氨基酸，以进一步鉴定二甲双胍抗 HIRI 诱导的高铁血症作用中的代谢物。
结果发现，只有 GABA 水平在二甲双胍处理和 FMT 处理后显著增加，ELISA 检测数据进一步验证了这一点，根据二甲双胍处理小鼠微生物的 16s rRNA 测序，还观察到 Bacteroides 属有明显增加。
特别是二甲双胍给药后，人肠道中的乳杆菌属（Bacteroides）中的Bacteroides_thetaiotaomicron、Bacteroides_unifomis和Bacteroides_salyersiae出现了上调，但二甲双胍并未上调这些酶的活性，这一点也被肝脏中GAD1和GAD2的Western印迹检测所证实。
更有趣的是，二甲双胍治疗组小鼠粪便中GABA浓度显著升高，IR + FMT组小鼠粪便中GABA浓度也显著升高，但抗生素治疗组小鼠粪便中GABA浓度不升高，为了进一步确定 GABA 的增加来源于肠道微生物群，我们在 DNA 水平上检测了原核细胞合成 GABA 的两种关键酶 GAD 和 PAT，发现这两种酶在 IR+Met 组和 IR+FMT 组的粪便中都显著增加。
考虑到安全系数较大，研究人员招募了健康志愿者进行为期一周、每天口服 500 毫克二甲双胍的试验，令人兴奋的是，体外和体内粪便实验结果表明，GABA 的产生增加，GAD 和 PAT 的表达增加，同时谷氨酸（Glu）减少，而谷氨酸是肠道微生物群合成 GABA 的关键底物。
但可惜的是GABA 合成的另一种底物--腐胺（putrescine）在初生培养基中未发现，但在发酵 24 小时后出现，随后在厌氧培养人体粪便实验中被消耗，综上所述二甲双胍可上调产生 GABA 的肠道微生物群。
结论
鉴于二甲双胍的多重作用，口服二甲双胍已被充分证明在处理HIRI时具有治疗效应，在当前研究中，二甲双胍引发的肠道微生物群变化被验证为对肝脏损伤保护具有必要且显著的影响，已确认二甲双胍通过抑制铁相关细胞死亡和重塑肠道微生物群来减轻HIRI的影响。
并且GABA的产生对维持微生物群的生存和代谢活性至关重要，特别是在pH值低于其他动物的人类肠道中，人体受益于微生物产生的GABA，外周GABA在1981年首次被证实存在于肠道微生物群中，并且最近的研究进一步证实了这一点。
除了在中枢神经系统和免疫系统中的关键作用，GABA在不同的急性肝损伤模型中也显示出保护作用，GABA通过与GABA受体结合或促进组蛋白乙酰化发挥有益作用，我们的实验数据显示，GABA治疗对于缓解HIRI诱导的铁相关细胞死亡具有保护作用。
并且我们通过重塑肠道微生物群，发现二甲双胍具有治疗HIRI的效应，二甲双胍治疗后，肠道菌群经历明显变化，这表明二甲双胍调整肠道微生物群增强了肠道黏膜功能，从而减少了对肝脏的有害物质，有效地避免了损害。
参考文献
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2.柯斌，利普舒茨 GS，库皮克-韦格林斯基 JW：（2006）肝脏缺血和再灌注损伤的基因治疗
3.梁华，宋浩，张晓等人：（2022）二甲双胍通过调节肠道微生物群减轻脓毒症相关肝损伤