文|郑法途说

编辑|郑法途说

前言

小麦是一种广泛种植的主要作物，在世界不同地区被用作面包、蛋糕、饼干、玉米饼、面食或其他食品。

虽然淀粉是小麦的主要成分，但谷物蛋白质含量对评估面粉的营养品质和功能特性至关重要。

而谷蛋白是小麦的储存蛋白，约占总谷物蛋白的80%，可能在6%到20%之间变化。

面筋具有独特的特性，即弹性，这决定了面包制作过程中面包的体积。

面筋蛋白属于原蛋白类，可分为两部分;醇溶性单体麦胶蛋白和不溶性聚合物麦胶蛋白。

根据其电泳迁移率，麦胶蛋白进一步分为α、β、ω和γ麦胶蛋白，而聚合物麦胶蛋白则分为高分子量(HMW-GS)和低分子量(LMW-GS)，分子量分别在67-90和30-45 kDa之间。

与气候变化相关，环境温度(最高/日和最低/夜)的升高是保持小麦质量的主要障碍。

印度作为第二大小麦生产国，3 - 4月的极端高温胁迫成为年度产量和出口的决定性因素。

上一季的报告显示，由于灌浆阶段的高温(>40°C)提前到来，南亚的面包篮产量下降了10%-15%。

较早前，夜间气温的季节变化表明，冬季(10 - 3月)夜间变暖幅度增加了0.28°C/ 10年，而夏季(6 - 9月)月份的夜间变暖幅度为0.19°C/ 10年。

由于棉花采摘晚、印度香米收获晚以及播种时灌溉用水减少，小麦的播种被无意地推迟到12月的最后两周或1月初，这使得小麦籽粒发育在3 - 4月期间被高温困住的风险增加，导致产量和质量下降。

在高温下，小麦籽粒中淀粉和蛋白质的数量和质量都会受到显著影响，导致面粉质量的属性下降。

小麦穗的形态，即中心、基部和顶部的小穗，由于籽粒灌浆速率的不同，籽粒重也不同。

随着开花从中间到末端的进展，穗的中心部分比顶部和基部显示出更高的粒重。

温度的升高会影响同化物在小穗中的分配，由于它们在穗内的位置，它们倾向于差异积累。

在此基础上，本研究通过在灌浆期将不同成熟度组(早、晚)的小麦基因型暴露于高温条件下，研究穗内面筋蛋白组成的空间变异，最终影响小麦面筋蛋白含量和沉淀值。

我们的研究结果将产生关于最低温度对面粉质量影响的知识，这将增加消费者日益增长的意识。

材料与方法

植物材料和生长条件

选择4个春小麦基因型HI 1544(适时播种推荐品种，常用作晚播对照品种)、HI 1563(晚播推荐品种)，生育期<120 d(早熟)，HD 2932和HD 2864(晚播推荐品种)，生育期≥130 d(晚熟)。

所有基因型，包括HI 1544(对照品种)，在2018-2019年期间在温室设施的非常晚的播种条件下(12月的最后一周)播种。

在容量为8.5 L(直径25.5 cm × 24 cm高)的盆栽中填入10 kg混合了农家肥和蚯蚓堆肥的土壤，每盆播种5粒种子，每个基因型保留10个盆栽。

氮磷钾推荐用量(120:60:40 kg/公顷)分别为尿素、单一过磷酸钾和钾盐。

分次施氮，三分之一在播种前施用，三分之二在第一个节期施用。

在第三叶期间伐至每罐三株。

植株从播种到孕穗期在环境条件下饲养。

在孕穗期，每个基因型5个盆栽分别转移到对照和高夜间温度(HNT)室，在那里保持12/12 h(日/夜)光周期，直到生理成熟。

采用两个尺寸为7.3 × 3.7 × 2.1 m(长×宽×高)的聚屋进行温度处理。

从下午6点至早上6点提供HNT治疗。

这些房间在白天保持开放，以便植物在白天经历相同的温度。

使用温湿度数据记录仪每30分钟记录一次温度。

从下午6点到早上6点记录的平均夜间温度分别为21.28°C(对照)和23.61°C (HNT)。

生长期日平均温度为29.9℃(图S1)。

粗蛋白和面筋蛋白组分的样品是在花后20天采集的，因为高温条件下面筋蛋白的积累在21 DAA时达到最大值。

为了收集优粒和劣粒的样品，将穗分成三部分(图S2)。

在小穗内，靠近轴的两个粒被集中取样。

对成熟后取样的颗粒进行了沉降试验。

由于储存蛋白主要在高温下约在7 - 14 DAA之间表达，因此对10 DAA收集的混合(优质和劣质)谷物样品进行了麦胶蛋白和谷蛋白各部分的基因表达分析。

沉降值的测定

面粉样品(6 g)置于刻度玻璃瓶中，与蒸馏水混合摇晃30秒。

在上述悬浮液中加入50 mL sds -乳酸试剂，倒吸16次。

让悬浮液静置10分钟，并记录面粉在圆筒中的沉降量(ml)。

每个样品的沉降体积一式三份。

粗蛋白质含量的测定

通过微凯氏定氮法估算谷物中的总氮含量，并将其乘以5.83的转换因子，在三个样品中测定总粗蛋白质。

用反相高效液相色谱法定量测定谷蛋白(麦胶蛋白和谷蛋白)蛋白组分

按照Schalk et al.(2017)的步骤，从三个重复的样品中依次提取麦胶蛋白和谷蛋白组分。

两个面筋组分均采用Axiva (0.2 μm)注射器过滤器过滤，采用Shim-pack GISS C18分析柱(10 × 250 mm;Shimadzu)，孔径为5 μm。

柱温保持在50℃。过滤后的样品(100 μL)入柱，以水/三氟乙酸(TFA) (99 /1, v/v)和*腈乙**/TFA (99 /1, v/v)两种流动相洗脱，梯度为0 min 0% B、0.5 min 24% B、20 min 56% B、20.1 ~ 24.1 min 90% B、24.2 ~ 30 min 0% B，流速为2 mL/min，在210 nm处检测吸光度。

各组分的保留时间间隔按照Wieser等人(1998)给出的方法进行，并用Lab Solutions (Shimadzu)软件对峰进行整合，以记录每个组分曲线下的峰面积。

基因表达分析

RNA分离及cDNA分析

采用Li & Trick(2005)的改进程序，从10 DAA收集的混合小麦种子(优质和劣质)的三个生物重复中提取总RNA。

简单地说，将优、劣籽粒各50 mg混合得到的种子样品(100 mg)，在500 μL含有100 mM Tris (pH 9.0)、150 mM NaCl、50 mM Na-EDTA、1.5% SDS和1.5% β-巯基乙醇的提取缓冲液中提取，以去除蛋白质。

将上述提取物大力混合，并在冰上静置10分钟。

孵育后，提取液中加入250 μL苯酚-氯仿混合物(1:1)，在4℃下，10000 g离心15 min。

将上水相转移到含有250 μL Trizol试剂的新鲜Eppendorf管中。

温和转温混合，室温孵育10分钟。

孵育后，加入250 μL氯仿异戊醇(24:1)，在4℃下，10000 g离心15 min。

将上水相转移到含有100 μL 2 M NaCl的epppendorf管中。

倒置混合，室温保存5min，异丙醇沉淀RNA。

从获得的RNA中提取10 μg，用DNase (Ambion)在37℃下处理30 min。

利用NanoDrop (Implen)检测RNA纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。

RNA保存在- 80°C，待进一步使用。

DNase酶切RNA (1 μg)使用PrimeScript™第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa Bio Inc)按照制造商的说明合成第一链cDNA。

Real-time qPCR检测

用基因特异性引物对α， ω-5， γ-麦胶蛋白进行实时荧光定量PCR;HMW-和LMW GS和18S rRNA(内参基因)利用IDT公司的Primer Quest Tool of Integrated DNA Technologies (IDT Inc.)在外显子-外显子边界上设计，并由Sigma-Aldrich合成(表S1)。

在所有实验中，18S rRNA均与靶基因平行扩增。所有的反应都是三次重复，有三个生物重复。

根据制造商的说明，使用Ampliqon RealQ Flex 2x Master Mix Green，在Bio-Rad CFX-96实时系统上进行反应。

采用2−∆∆CT法分析对照和处理过hnt的样品之间的相对基因表达水平(Livak & Schmittgen, 2001)。

统计分析

各参数数据采用单因素方差分析(ANOVA)和配对t检验，采用SPSS软件(SPSS Inc.)对所得数据进行统计分析。

经Tukey事后检验，p≤。0.05例取平均值。

使用R软件中的G Gally软件包计算麦胶蛋白和谷蛋白组分与控制下沉降体积和HNT之间的Pearson相关性。

结果

高温下蛋白质含量的变化

在HNT条件下，面粉蛋白质含量显著增加(p = 0.006)(图1)。

然而，当夜间温度升高时，HD 2864并没有变化。

其他基因型的蛋白质含量增加幅度在1.96% ~ 3.00%之间(图1)。

HNT对所有基因型的千粒重没有显著影响(图S3插入图)。

面粉在高温下的沉降体积

HNT显著影响面粉沉降量(图2)(p = 0.004)。

所有基因型在HNT处理下均降低了8.99% ~ 19.78%。

在早熟品种HI 1563中观察到最大的SV下降，而成熟较晚的基因型HD 2932和HD 2864也显示出类似的值下降(图2)。

HNT作用下α/β-、ω-5、γ-醇溶蛋白组分的变化

总的来说，α/β-麦胶蛋白占麦胶蛋白的最大比例，其次是γ-和ω-5麦胶蛋白(图3a,b)。

在高温胁迫下，麦胶蛋白的积累因基因型和籽粒在穗上的位置而发生变化。

晚熟基因型HD 2932和HD 2864在劣势和优势粒型中各组分均有变化，而早熟基因型HI 1544在劣势粒型中仅在α/β和γ组分上有显著差异。

HI 1563基因型在α/β和ω-5亚组分上均较为稳定。

我们观察到灌浆期间夜间温度升高时γ-麦胶蛋白组分的差异基因型反应。

早熟基因型(HI 1544和HI 1563)和晚熟基因型(HD 2932和HD 2864)的劣势籽粒γ-麦胶蛋白均有不同程度的变化。

在高温处理下，h1544的劣粒含量降低(17.60%)，h1563的劣粒含量升高(8.99%)。

同时,减少积累在HD 2864优越的伪劣谷物,6.33%和23.12,分别和HD 2932的增加,7.96%和12.18,分别观察HNT之下。

HNT对高分子量和低分子量谷蛋白组分积累的影响

无论谷物类型和温度处理如何，低分子量谷蛋白的积累量都高于高分子量谷蛋白(图4a,b)。

总体而言，不论基因型和处理，优、劣粒的平均LMW和HMW谷蛋白积累量均在64.22% ~ 64.83%和35.77% ~ 35.16%之间。

在高温处理下，早熟的HI 1544和晚熟的HD 2932两种籽型的HMW分数均显著增加。

在HNT处理下，两种基因型的LMW分数均显著下降。

在两种生长环境下，HD 2864对这两种谷蛋白的积累都是稳定的。

麦胶蛋白和谷蛋白组分与沉降体积的关系与HMW (r = 0.43*)和LMW谷蛋白(r = 0.81**)呈显著正相关(表1)。

表1。对照和HNT条件下混合优质和劣质籽粒中麦胶蛋白和谷蛋白亚组分与小麦基因型沉降体积(sv沉降体积)的相关性

除HD 2864外，所有基因型在HNT下均观察到麦胶蛋白与谷蛋白比例显著增加(图S4)。早熟基因型HI 1544的增幅最大(1.32)。早熟基因型HI 1563和晚熟基因型HD 2932的增幅相同。

麦胶蛋白和谷蛋白组分基因的差异表达

为了评估HNT对α/β， ω-5和γ麦胶蛋白以及HMW, LMW GS的总体影响，将这些分数在优等和劣等谷物中的数据汇总(表S2)。

结果表明，在高温处理下，早熟品种HI 1544和晚熟品种HD 2864的α/β和ω-5麦胶蛋白含量显著升高。

然而，在这些基因型中观察到γ-麦胶蛋白积累的相反趋势。两种温度处理下，HI 1563的麦胶蛋白组分在高温下积累的稳定性都很明显。

我们评估了优质和劣质谷物样本中麦胶蛋白和谷蛋白部分基因的相对表达量，以观察10 DAA时转录水平的变化。

总的来说，与各自的对照组相比，HNT处理下所有基因型的α-麦胶蛋白基因的表达均显著降低(图5a)。

晚熟基因型HD 2864和HD 2932在HNT处理下转录物丰度降低幅度最大，分别为0.15和0.21倍。

早熟基因型HI 1544和HI 1563的表达量下降幅度相同(分别为0.80和0.65倍)。

同样，在HNT下生长的所有基因型中，ω-5麦胶蛋白基因也下调，尽管观察到显著的基因型差异(图5b)。

晚熟基因型HD 2932和HD 2864在HNT处理下的表达量较对照降低幅度最大。早熟基因型HI 1544和HI 1563的下调幅度明显小于晚熟基因型。

在HNT条件下，所有基因型的γ麦胶蛋白表达均显著降低(图5c)。在早熟基因型HI 1563中，表达量下降幅度最小。

早、晚熟的HI 1544和HD 2864在HNT处理下表达量分别下降了0.31倍和0.47倍。

与对照组相比，HNT条件下所有基因型的HMW谷蛋白表达均显著下调(图5d)。

在早熟和晚熟的HI 1544和HD 2932中，表达量相似(分别为0.54倍和0.52倍)。

另一方面，hi1563和hd2864在HNT下的表达量与对照相比分别降低了0.02倍和0.07倍，也有类似的观察结果。

在HNT下，LMW谷蛋白的表达模式发生了基因型变化(图5e)。

在基因型HI 1544和HD 2932中，LMW谷蛋白的表达在HNT下均有相同程度的下调，而在基因型HI 1563中，LMW谷蛋白的表达比对照降低了0.45倍。

在两种生长条件下，HD 2864中LMW谷蛋白转录本水平变化不显著。

结论

面筋的质量取决于储存的蛋白质成分，麦胶蛋白和谷蛋白，它们在面包制作过程中相互作用，赋予面团粘弹性。

在谷物发育过程中，麦胶蛋白和谷蛋白的数量和比例会随着基因型和环境的变化而变化。

夜间温度升高导致除HD 2864外的所有基因型的麦胶蛋白与谷蛋白之比升高，这可以解释为高温下总谷蛋白减少的结果。

最近的一项研究表明，花期的高温增加了蛋白质含量和麦胶蛋白与谷蛋白的比例，而与品种的敏感性无关。

热胁迫下的高麦胶蛋白合成导致面团性质变弱，这与α/β-麦胶蛋白基因中存在热休克元素有关。