编者按
角膜是折射光线、聚焦成像的重要组织结构，其透明度是维持视力至关重要的因素。角膜上皮损伤能通过角膜缘干细胞增殖得以修复，角膜基质损伤会继发细胞外间质排列紊乱继发角膜瘢痕化，角膜内皮损伤会引起角膜水肿混浊。很多原发角膜病变、角膜外伤和角膜感染都会显著降低视力，甚至导致失明。角膜移植是治疗角膜瘢痕和角膜内皮失代偿的有效手段，但角膜供体缺乏、排斥反应和植片存活状态都限制了角膜移植大规模开展。因此，寻求新的角膜再生疗法对角膜损伤重建、提高视力水平极为重要。角膜基质干细胞、角膜缘干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞及其分泌蛋白和外泌体等都可能参与该过程，为角膜再生临床转化提供了新的机遇和挑战，未来角膜病变的治疗可能进入到细胞治疗的时代。近期，Professor Du Yiqin 及其团队对角膜再生治疗的相关研究进行了归纳总结，相关结果发表于Progress in Retinal and Eye Research（影响因子21.198）杂志上。
干细胞及其营养因子的作用
干细胞是一种在体内缓慢循环、保留标记的细胞，具有自我更新和克隆扩增、无限或长期增殖的能力。胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（IPSC）理论上可以分化为所有类型的功能细胞；角膜缘干细胞（LSC）、角膜基质干细胞（CSSC）、充质干细胞（MSC）、脂肪源性干细胞（ASC）可以分化为特定功能细胞。其中，LSC位于Vogt栅下角膜缘上皮基底层，CSSC位于LSC基底层下特定干细胞小凹，角膜内皮干细胞的特征尚不明确，可能由位于角膜内皮和小梁网间的双重干细胞分化而来。在转化研究和临床实践中LSC在角膜化学伤和热烫伤的治疗上已经取得了重大进展，也有外源性CSSC预防和逆转角膜瘢痕的报道。
外泌体、微囊泡、细胞外囊泡和干细胞蛋白分泌组是干细胞与周围微环境相互作用和沟通的桥梁，其内包含可溶性蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、miRNA和生物活性脂质等，能够广泛调节细胞功能，在视网膜疾病和角膜损伤愈合的治疗已有相关报道。由于细胞外囊泡和外泌体可以从细胞中大量提取、分离并浓缩以更好的发挥其功能，Ratajczak等提出的无细胞疗法与干细胞治疗相比，对患者造成的损伤更小且有更好的安全性，这可能是未来的全新研究领域。
干细胞诱导角膜再生的研究进展
CSSC的分布位置相对固定，其特异性表达ABCG2和Pax 6可被特定染色剂Hoechst 33、342标记便于分离并保留其干细胞特征。在不影响角膜功能的前提下通过局部活检从供体或患者自体提取CSSC作为角膜再生来源。Du等对硫酸角蛋白多糖缺乏的Lum−/-小鼠角膜基质注射人CSSC后并没有明显炎症反应，病变的角膜纤维组织直径和间距均匀，随着角膜混浊减退角膜厚度和透明度均恢复到正常水平，且CSSC在移植后4月仍然存活。除角膜基质注射，Basu等通过应用纤维蛋白胶将CSSC固定于去除角膜上皮和前弹力层的角膜表面。移植后CSSC分泌正常的人角化蛋白和I型胶原，再生角膜纤维均匀致密，减少了角膜中的光散射并预防瘢痕形成。
除人CSSC可用于角膜基质再生外，其他源于眼和其他组织的干细胞也被用于研究角膜再生的潜力。胚胎干细胞（ESC）在体外与小鼠PA6成纤维细胞共培养可诱导表达CD271、p75NTR、SNA11、NTRK3、SOX9、MSX1等细胞标记物，在抗坏血酸缓解下ESC可被诱导分化为角化细胞并分泌硫酸角质素，这是维持角膜透明必需的分子；脂肪源性干细胞（ASC）源于脂肪组织，容易获得并能高效实现角膜再生，将ASC注入在兔角膜基质融解模型中通过表达keratocan和ALDH3A1分化成功能性角膜角质细胞修复角膜损伤；牙髓干细胞（DPSC）与角膜基质细胞具有相同的胚胎起源，并具有分化为角膜基质细胞的潜力；脐带干细胞（UMSC）可在基质内移植后分化为角膜基质细胞，形成广泛的树突、分泌体和角膜蛋白。
基于组织工程技术角膜再生的应用
常规培养基体外培养的角膜基质多为片状结构，而在不同类型纳米生物材料支架立体培养可制造模拟天然角膜结构，更好的用于体内移植以恢复角膜透明并提高视力。复合酯聚氨酯尿素（PEUU）材料是一种生物相容性极好的支架结构，CSSC移植后可分化为基质细胞，通过成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和转化生长因子-β3（TGF-β3）诱导可在支架表面沉积多层致密的Ⅰ型胶原纤维，其规律排列可高度模拟人角膜基质组织。此外，丝纤维素和聚碳酸酯也可作为CSSC的支架结构。
CSSC虽然在3D立体纳米生物材料支架可产生角膜组织，但不易与支架分离，这一定程度上限制了临床应用。在理想的无支架组织工程2D培养条件下，干细胞大量分泌细胞外基质从而形成组织薄片。Syed-Picard等将CSSC培养在具有排列微槽的基质上形成了一层仿生角膜基质组织结构，在该结构中胶原排列均与规律，包含Ⅰ型和Ⅴ型胶原和角化蛋白，类似于天然人角膜基质并易于可通过机械或化学方法取出。Syed-Picard等将再生角膜片植入小鼠基质囊袋中持续透明并表现与原角膜相似的曲率。
角膜再生疗法的前景和展望
目前角膜再生疗法在不同的动物模型中疗效尚不稳定，在临床转化前制定统一的干细胞质控规范将极大提高治疗成功率。此外，辅助3D生物打印技术可设计更具创新性的生物载体材料，有助于提高其兼容性和仿生性，减少细胞凋亡并预防炎症反应和新生血管等并发症。将干细胞分泌的外泌体、细胞外囊泡以滴眼液的形式局部应用可加速临床转化进程并减少治疗损伤，通过使用缓释凝胶、纳米微球或绷带镜载体介导可增加活性成分在角膜表面作用时间。角膜再生治疗后通过进一步促进角膜神经再生、逆转角膜混浊，为角膜盲患者重见光明开辟了另一条崭新的途径。
参考文献：Kumar A, Yun H, Funderburgh ML, Du Y. Regenerative therapy for the Cornea. Progress in Retinal and eye Research. 2022 Mar;87:101011. DOI: 10.1016/j.preteyeres.2021.101011. PMID: 34530154.