«——【·前言·】——»
表面活性剂是两亲性分子，能够改变两个表面之间的表面张力。它们可以通过各种方法获得，主要的方法是从石油基基质中合成。它们在广泛领域的普遍使用创造了一个全球市场，并因此产生了对其生产的生态和经济期望。
包括酶在内的生物催化过程可以通过符合绿色化学原则的过程来实现这一目标:节能、产品选择性、单分散性和减少溶剂的使用，具有能源生态效率。例如，脂肪酸碳水化合物酯是可以由脂肪酶合成的生物基表面活性剂。
在这项工作中，我们对D-葡萄糖月桂酸酯的合成感兴趣，它具有文献中描述的有趣性质黑曲霉脂肪酶，很少用糖底物来描述。我们优化了不同参数和反应介质的合成。这种脂肪酶似乎对6-位具有高度选择性O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖。
添加DMSO(二甲基*砜亚**)作为共溶剂显示出双重性，增加了产率但导致选择性损失。DMSO产生更复杂和高能耗的纯化和加工步骤。提出了一种生物来源的替代品，作为2-甲基四氢呋喃-3-酮的助溶剂，取代文献中广泛描述的二甲基*砜亚**。
«——【·介绍·】——»
表面活性剂是化学工业生产的重要组成部分一。其中，糖类表面活性剂是特别令人感兴趣的表面活性剂。它们无毒、无刺激性、可生物降解，其中一些还具有杀虫作用和抗菌特性。这种分子集合主要通过化学或微生物过程获得，特别是对于碳水化合物基表面活性剂如鼠李糖脂。
微生物的使用产生了显著的成本增加，特别是对于纯化而言，并且更重要的是，在生物合成过程中产生的相对少量是一个关键的限制因素。一种替代方案是转向所谓的经典和常规化学合成，特别是在合成成本方面，尽管这种化学很难用碳水化合物来实现。
这些步骤成本很高，并且使合成变得复杂，酶具有很大的灵活性和适应性，事实上，它们的活性位点可以在各种温度条件和替代溶剂下与各种底物相互作用，使用的主要酶是脂肪酶，它催化酯化和水解反应。它们可用于多个领域。
脂肪酶催化的酯形成反应的动力学受几个因素控制(温度、反应时间、搅拌、底物、底物比例、反应介质等)。必须进行优化以提高产量或减少最终产品的总体碳足迹。对于酶的选择，有必要寻找廉价和催化有效的脂肪酶。
我们选择了一个固定的商业项目黑曲霉脂肪酶。黑曲霉据报道，脂肪酶催化各种二羧酸和二醇合成酯而且在生物柴油生产中也是如此。关于使用的数据有限黑曲霉对于糖酯的合成，尽管其对于这些分子的合成具有良好的催化活性。
选择酶后，研究酶促合成时要考虑的第一个参数是反应溶剂，酶促糖酯合成中的挑战是找到合适的溶剂来溶解几乎相反极性的底物，而不使酶失活。有必要比较溶剂的logP来选择反应介质。
THF通过减少蛋白质微环境中的水分含量来部分灭活这种酶。其它溶剂，如DMSO(二甲基*砜亚**)、吡啶或DMF被认为是能够溶解几乎所有有机分子的通用溶剂。许多研究工作都使用叔醇，或者通过在糖中饱和溶液，或通过以可变比例加入增溶剂。
叔醇的优点是不是脂肪酶的底物，因此不会干扰主反应。叔醇对酶没有失活作用。据报道，叔醇也存在于助溶剂体系中。最近，农基溶剂受到了关注，如四氢呋喃的甲基化衍生物，它们是生物基的，毒性比THF低，但价格昂贵。
混合有机溶剂，即所谓的助溶剂，通常比单一溶剂更优选，因为溶剂比允许反应开始时溶解度的变化。然后可以控制酰基受体的溶解度，从而控制酶的活性。
在糖酯的酶促合成中要考虑的另一个参数是试剂类型，即游离羧酸或相应的酯，以通过酶促反应改善糖酯的合成。这就是酯交换反应，其中通常用甲酯、乙酯和乙烯基酯代替羧酸作为酰基试剂。
本研究的重点是优化合成6-羟基喹啉的参数O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖黑曲霉脂肪酶，随后是在不同反应介质中的选择性研究。然后提出并讨论了DMSO的可持续共溶剂替代物。
«——【·材料和方法·】——»
分子筛3(10%w/v)，D-葡萄糖(0.18克，1毫摩尔，1当量)和脂肪试剂(3毫摩尔，3当量)在2M2B或tert-你好。对于涉及共溶剂DMSO(20%，v/v)随后被添加。将反应混合物以240rpm搅拌，并在热费雪MaxQ4450封闭恒温装置中加热至56℃。
加热1小时后，获得均匀的介质，并取样进行TLC动力学和HPLC分析(t0).黑曲霉最后以1%(w/v).与反应平行，不含酶的反应介质被系统地用作阴性对照。对于每次合成，反应混合物在真空下过滤，用2M2B洗涤，并在减压下蒸发。
用水和二氯甲烷进行萃取以除去过量的未反应的D-葡萄糖。有机层在硫酸镁中干燥四并在减压下蒸发。然后使用石油醚/乙酸乙酯梯度混合物作为流动相进行快速色谱纯化，以除去过量的未反应的脂肪试剂。甲醇/乙酸乙酯1∶4(v/v)混合物，然后用于回收所需产物。
对于每次合成，使用LC-20ADSP泵和辛克隆尼斯C18柱，保持在40℃下，通过HPLC跟踪反应进程。使用折光率检测器RID-20A进行检测。甲醇/水9:1(v/v)用作流动相，持续可变的时间，根据脂肪试剂。反应一段时间后，通过将介质冷却至室温来停止反应。将样品进行TLC和HPLC分析。
为了清楚地分析HPLC中检测到的不同产物和试剂，使用C12、C12Et和C12V作为标准品，在存在和不存在DMSO的情况下进行校准，以观察DMSO对保留时间的影响。标准也在含有C12Et或C12V和酶的阴性对照反应中进行。
量化O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖是在反应过程中产生的。使用6-进行外部校准O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖，其结构通过NMR光谱确认，作为标准。在2M2B的过滤和蒸发步骤后进行定量的等分。
取100L含DMSO的残余介质，并与甲醇混合。对于没有DMSO的反应，蒸发过滤的反应介质，将残余物溶解在DMSO中，并与甲醇混合，在相同条件下进行分析。
«——【·结果和讨论·】——»
在我们调查的最初阶段，6-O选择-月桂酰-D-吡喃葡萄糖作为参考合成，用于设置参数黑曲霉脂肪酶。这种脂肪酶的比活≥5000U/g，因此具有有趣的特性。
关于所研究的D-葡萄糖酯，月桂酸与常规脂肪酸(C8–C18)相比具有中等大小。这种脂肪酸在文献中被广泛描述为糖两亲物的应用方面，具有有趣的临界胶束浓度(CMC)和最小抑制浓度(MIC)。
脂肪酶催化反应的动力学受多种因素影响。大量研究将叔醇描述为葡萄糖酯合成的最佳溶剂。这些合成中最广泛使用的是叔丁基羟基。这些溶剂通常与增溶剂如DMSO、吡啶或DMF结合使用，因为它们具有溶解几乎所有分子的能力。
使用2M2B或tert-用DMSO代替纯2M2B作为溶剂的BuOH，或tert-BuOH已在文献中显示以提高D-葡萄糖与脂肪酸的酶促反应产率，因为它们能够增加D-葡萄糖的溶解度。而且，2M2B，tert-BuOH和DMSO的logP分别为0.89、0.35和1.35。
当DSMO作为20%的助溶剂与2M2B或tert-BuOH，反应开始时D-葡萄糖的溶解度分别为5.73g/L和6.56g/L。作为共溶剂的DMSO增加了D-葡萄糖的溶解度，从而提高了其生物利用度。
脂肪酸酯化的替代方法是酯交换。它使用比脂肪酸更活泼的醇酯，其副产物是相应的醇。与酯化反应产生的水相比，这种醇对酶平衡的影响较小。
在1∶2d-葡萄糖/碳链比的条件下，用月桂酸乙烯酯(C12V)作为酰基供体的酯交换比用月桂酸乙酯(C12Et)作为酰基供体的酯交换(23%)和酯化(22%)产生更好的产率(48%)。
当D-葡萄糖/碳链比为1:3时，以月桂酸和月桂酸乙酯为酰基供体，摩尔产率显著增加，分别为35%和44%。通过与月桂酸乙烯酯(C12V)以1∶3(46%)的比例进行酯交换获得了可比较的结果。
使用月桂酸乙酯作为酰基供体优化了化合物的合成，其中D-葡萄糖/酰基链比为1:3D。事实上，酯交换反应的产率系统地更好，并且与月桂酸乙烯酯相比，月桂酸乙酯对释放的副产物的影响没有太多疑问。
重复迄今产生的最佳条件，即2M2B/DMSO20%(v/v)混合物和1摩尔当量的葡萄糖对3摩尔当量的C12Et的比例。随后优化反应时间、温度和搅拌参数。获得的最佳条件被保留以改变下一个条件。
我们研究了不同反应时间(即24小时、48小时和72小时)对D-葡萄糖月桂酸酯摩尔产率。24小时的反应时间导致14%的产率、48小时到53%的产率和72小时到44%的产率。
为什么48h导致更好的产率的一个可能的解释是在合成过程中新形成的产物葡萄糖单酯的变性或转化。单酯可以代替D-葡萄糖成为脂肪酶的优选底物，从而产生双酯。
另一种解释可能是随着时间的推移，在过量酯化底物存在下，脂肪酶不能尽可能地避免水解反应。在余下的研究中，反应时间将设定为48小时。
温度也在反应合成中发挥重要作用，通过影响两个方面:酶活性和底物溶解度。没有关于使用这种商业脂肪酶的数据黑曲霉糖酯的合成，因此有兴趣了解更多关于这种脂肪酶。在这里，我们评估了6-O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖的合成在各种反应温度下的产率:32℃、44℃、56℃和68℃。
在56℃下获得的D-葡萄糖月桂酸酯产率(53%)高于在32℃、44℃和68℃下获得的产率(分别为19%、25%和17%)。为了合成D-葡萄糖酯月桂酸酯，黑曲霉脂肪酶在56°C左右表现出最佳的催化活性范围。在68°C时观察到的产量下降可以用蛋白质变性来解释，这通常发生在60°C以上的温度。
搅拌对反应效率有非常显著的影响。在120rpm和180rpm下搅拌时，单酯产率相似(36%和38%)，而在240rpm下产率高得多(53%)。这主要是由于固定在树脂上的酶遇到试剂的可能性增加了。
通过酶催化生产两亲物的优点是节约能源，并且由于高选择性，在反应和加工阶段，特别是纯化过程中减少了石油基溶剂的使用。在经典化学中，所获得的分子存在相当大的异质性，这与多分散性和/或多取代有关，但也是由于缺乏反应立体选择性。
在我们的参考条件下(56°C–48小时–240转/分，在20毫升2M2B中，D-葡萄糖/碳链比为1:3，1克3”分子筛)，测定酯化反应和酯交换反应的接枝选择性。阴性对照合成与脂肪酶催化的反应同时进行。这些合成允许证实(或不证实)合成产生的反应产物仅仅是由于脂肪酶活性。
在2M2B溶剂中，在没有酶(CTL)的情况下，没有D-葡萄糖的月桂酸酯的合成。因此，2M2B没有合成活性。当加入酶时，纯化后C12的摩尔产率为24%，C12Et为47%，C12V为49%。
DMSO作为具有2M2B的共溶剂，似乎具有显著的积极影响。事实上，通过酯化，摩尔产率增加到35%，通过与C12Et和C12V的酯交换分别增加到53%和72%。与2M2B条件相比，这分别代表了40%、15%和41%的增加。
在DMSO共溶剂存在下，没有脂肪酶的对照合成以低收率产生了月桂酰-D-吡喃葡萄糖，C12约9%，C12Et约10%，C12V约6%。MS分析对应于月桂酰-D-吡喃葡萄糖，峰值在m/z384.6对应于[M+Na]+。这些结果突出了DMSO少量催化D-葡萄糖酯化和酯交换反应的能力。
核磁共振分析表明没有选择性，这通过以下物质的存在来证明一核磁共振氢谱，4ppm和5.5ppm之间的弱信号和170ppm和173ppm(C=O)之间的信号13无论酰基供体是什么，两种反应路线中的CNMR谱表明酯形成位点的可变性。在文献中，DMSO已经显示出催化棕榈酸和油酸形成糖酯，但不是在酯交换过程中。
根据所研究的反应，月桂酸或其酯衍生物也被用作标准。在反应动力学中，在没有DMSO的反应条件下，根据合成条件，可以在3.40分钟检测到单酯，在5.3分钟检测到C12脂肪酸，或在9.93分钟检测到C12Et，或在11.31分钟检测到C12V。
在使用DMSO和脂肪酶的合成中，先前被鉴定为酰基供体的峰的保留时间发现其保留时间对于C12而言略微降低至5.32分钟至5.11分钟，对于C12Et而言从5.33分钟至5.17分钟，对于C12V而言从5.31分钟至5.11分钟。
对于没有DMSO的条件，质量分析确定了碳链的独特存在。相反，对于含有DMSO的馏分，检测到二月桂酰-D-吡喃葡萄糖。
事实上，质谱清楚地表明在这些馏分中存在月桂酸[M+K]的混合物+在m/z239和二酯，用[M+Na]表示+在m/z566.5。这些分析表明，无论酰基供体是什么，在2M2B/DMSO20%条件下进行的合成中都存在二酯。
即使二酯的生成量低，这也表明由于DMSO催化活性而损失了选择性。这种产生的分散性是一个问题，因为它将限制合成产物的简化应用和/或复杂的纯化。HPLC也用于定量合成的6-的量O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖，通过NMR分析证实，在反应结束时。可以注意到，当使用DMSO时，在纯化步骤中损失的产物量更高。
这些研究不涉及糖酯。在工业过程中，DMSO由于其高沸点而更难从最终产品中除去。这些困难将限制该产品作为DMSO的应用。考虑到其对生物，特别是水生生物的潜在毒性，需要研究和监测DMSO进入环境的情况。特别是，生物降解性和细胞毒性使得作为共溶剂的DMSO成为所生产分子应用中的一个限制因素。
测试了两种生物基助溶剂来替代DMSO:2MeTHF和2MeTHF3one。2MeTHF是一种农用溶剂，来源于糠醛，糠醛本身来源于农业副产品，是一种可持续的替代溶剂。第二选择，2MeTHF3one是一种食品级溶剂，GRAS(公认安全)，来源于咖啡呋喃酮。
它适用于食品工业，因此2MeTHF3one更容易应用。这两种溶剂也比DMSO更容易从反应介质中除去，因为它们的沸点较低，分别为78℃和138℃，而DMSO的沸点为190℃。
2M2B/2methF3酮(20%v/v)混合物在56℃下平均溶解3.2克/升D-葡萄糖，表明有兴趣使用2MeTHF3one作为助溶剂，以增加反应开始时糖的生物利用度。2MeTHF3one的logP为0.563，与DMSO一样为负值。在混合物中，2M2B/2methF3酮(20%v/v)的logP为0.59。
通过用2methF3酮代替DMSO进行合成。该混合物给出了接近2M2B(0.89)的logP，同时溶解了更多的D-葡萄糖。我们因此执行了6-O使用2M2B/2methF3酮合成-月桂酰-D-吡喃葡萄糖(20%v/v)作为溶剂，使用先前建立的反应条件。
对于与月桂酸的酯化反应，获得的产率为42%，这比用DMSO共溶剂(33%)进行的合成更高(产率增加27%)。通过与月桂酸乙酯的酯交换，我们获得了49%的产率，与在共溶剂DMSO存在下获得的产率(52%)没有显著差异。
对于用月桂酸乙烯酯进行的合成，产率高得多，纯化后平均产率为80%，与2M2B/DMSO条件(71%产率)相比显著增加。这不仅显示了2methF3酮替代DMSO的潜力，而且显示了合成后处理步骤的简易性。
«——【·结论·】——»
我们测定了6-的动力学参数O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖的合成黑曲霉脂肪酶:56℃,48小时，240转/分，D-葡萄糖/酰基链1:3。我们观察到酯交换反应的效率更高。
该脂肪酶对6-位的特异性合成表现出非常高的接枝选择性O-月桂酰-D-吡喃葡萄糖。正如所料，使用20%的DMSO作为共溶剂(v/v)增加反应产率。DMSO也能够催化D-葡萄糖酯化和酯交换，据我们所知，这以前从未报道过。
在我们的实验中，使用DMSO作为共溶剂也允许合成除单酯之外的二酯，导致酶催化合成的选择性损失。在DMSO存在下的纯化步骤非常耗能，并且不一定导致生态有效的过程。
由于2MeTHF3one对其去除不存在困难，其单独用作溶剂也是可能的。这种溶剂的价格仍然很高(538欧元/千克)，目前不允许其作为绿色溶剂大规模使用。因此，它在酶促合成中作为共溶剂的用途提供了设想2methF3酮的合理应用的可能性。这最后一点加强了这种食品级溶剂作为助溶剂的重要性。
«——【·参考文献·】——»
【1】德莱乌：《从可再生蔬菜资源到微生物:表面活性剂的新趋势》，2004年。
【2】索萨，苏亚雷斯·达席尔瓦卢娜，弗吉尼亚州桑托斯，巴纳特：《绿色表面活性剂的生产:市场前景》，电子生物技术。2021年。
【3】普特卡，法隆，帕尔默：《影响糖酯杀虫和杀螨活性的结构-功能关系》，经济学，昆虫学家，2003年。
【4】费雷尔，索里韦里，普卢，洛佩斯-科尔特斯，雷耶斯-杜阿尔特博士，克里斯滕森：《来自疏绵状高温霉和南极假丝酵母的脂肪酶在溶剂混合物中合成糖酯及其抗微生物特性》，酵素技术，2005年。