编译：微科盟公虾米，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
茶叶品种对抹茶品质的形成起着至关重要的作用。本研究旨在探讨4个特定的茶树品种(晚绿：Oku、龙井43：LJ43、中茶108：ZC108和鄂茶一号：EC1)对抹茶的感官评价、主要成分、色泽质量、挥发性和非挥发性代谢组学特征的影响。研究结果显示，茶多酚、酯型儿茶素、非酯型儿茶素和氨基酸的含量在这4种抹茶之间存在差异。我们在1383种非挥发性化合物中鉴定出177种显著差异代谢物，如酚酸、类黄酮、单宁、生物碱等。此外，根据气味活性值大于1，我们鉴定出97种关键芳香活性化合物。醛类、杂环化合物和酮类与挥发性代谢物的形成密切相关。综上所述，本研究加深了我们对不同茶树品种对抹茶品质影响的认识，可以为抹茶朝着有利的方向改良提供有价值的指导。
论文ID
原名： A comprehensive metabolomics analysis of volatile and non-volatile compounds in matcha processed from different tea varieties
译名： 不同茶叶品种加工的抹茶中挥发性和非挥发性化合物的综合代谢组学分析
期刊： Food Chemistry: X
IF： 6.1
发表时间： 2024.02
通讯作者： 毛迎新
通讯作者单位： 湖北省农业科学院果树茶叶研究所
实验设计
实验结果
1.不同抹茶的感官评价
对于生产商、经销商和消费者来说，有关抹茶的色泽、风味和香气质量的信息在影响产品的生产、选择或购买方面起着至关重要的作用。图 1 和表 S1 展示了四种不同抹茶粉末和茶汤的视觉外观，以及色泽评估结果。其中，Oku品种的抹茶在外观和茶汤色泽方面的值最高，其特点是绿色鲜艳且有光泽。味觉方面，LJ43得分最高(95.30)，其次是Oku(93.3)、ZC108(91.17)和EC1(85.8)。所有抹茶都表现出典型的海苔味，这是抹茶的特征。值得注意的是，Oku表现出了一种卓越的特征：香气清鲜，海苔味浓烈而持久。LJ43也表现出良好的香气特征，与之前对Oku和LJ43制备的碾茶的评价一致。相比之下，EC1的香气相对不那么清鲜，有海苔味，但不那么浓烈和持久，其得分最低为85.93。综上所述，4个抹茶的总分从高到低依次为Oku、LJ43、ZC108和EC1。Oku与LJ43的整体表现无明显差异。
图1 四个不同抹茶的外观和茶汤颜色。
2.不同抹茶主要成分及色泽品质分析
抹茶的口感质量取决于茶多酚(TPS)、儿茶素、咖啡因(CAF)和氨基酸等主要成分的平衡。如表1所示，EC1中的TPS含量最高( P < 0.05)，其他3种抹茶间差异不显著。Oku抹茶中的儿茶素总量(TAC)和总酯型儿茶素(TEC)含量均显著低于其他抹茶。总酯型儿茶素的苦味和涩味高于总非酯型儿茶素(TNEC)，促使总非酯型儿茶素与总酯型儿茶素的比值(TNEC/TEC)与感官味觉之间存在显著相关性。Oku和EC1抹茶中的TNEC/TEC值较高，LJ43和ZC108次之。CAF在绿茶的苦味中起着关键作用，对儿茶素的涩味也有积极影响。相反，鲜味氨基酸抑制了儿茶素的苦味和涩味，而儿茶素对绿茶的味道调节至关重要。本研究中，4种抹茶间CAF含量差异不显著，而游离氨基酸（FFAs）含量差异显著( P < 0.05)，表现为ZC108 > LJ43 > EC1 > Oku。
表1 四种抹茶的主要成分分析
注:所有数值均以均数±标准差表示。同一行中不同的字母(a-d)表示四种抹茶品种之间存在显著差异 (P < 0.05)。Oku：晚绿；LJ43：龙井43；ZC108：中茶108；EC1：鄂茶一号. TPs：茶多酚；EC：表儿茶素；EGC：表没食子儿茶素；C：儿茶素；GC：没食子儿茶素；ECG：表儿茶素没食子酸酯；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；CG：儿茶素没食子酸酯；GCG：没食子儿茶素没食子酸酯；TAC：总儿茶素; TNEC：总非酯型儿茶素; TEC, 总酯型儿茶素; TNEC/TEC, TNEC/TEC的比率; CAF,咖啡因; FAA, 游离氨基酸。
叶绿素和类胡萝卜素含量及色泽质量见表S2。Oku抹茶的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量(a + b)显著高于其他品种。而LJ43与ZC108抹茶之间差异不显著。类胡萝卜素含量排序为:EC1 > LJ43 > ZC108 > Oku。色泽质量通过L(亮度)、a(绿/红色度)和b(黄色度)进一步评估。在Oku、LJ43和ZC108抹茶之间，抹茶粉末和茶汤的L值无显著差异，但显著高于EC1抹茶。抹茶粉末的a值也表现出相同的规律，而茶汤的a值在Oku和LJ43抹茶之间以及ZC108和EC1抹茶之间没有显著差异。至于b值，Oku与EC1无显著差异。EC1茶汤的黄度明显高于其他品种，亮度明显低于其他品种，这与茶汤的颜色外观一致。因此，尽管EC1抹茶中的叶绿素含量较高，但由于类胡萝卜素含量升高，其粉末的颜色偏黄，茶汤的亮度降低，黄度增加。
3.四种抹茶非挥发性代谢物的表征
3.1四种抹茶非挥发性代谢物的综合分析
我们对来自不同茶树品种的4种抹茶样本中的非挥发性代谢物进行了全面评估，非挥发性代谢物包括 12 个类别，共计 1383 种化合物。在分析中，我们使用了已建立的数据库中的 MS/MS 图谱数据和自建的 metWare 代谢物数据库。这些非挥发性代谢物类别包括醌类（12种）、萜类（31种）、单宁（34种）、木脂素和香豆素（53种）、核苷酸及其衍生物（74种）、有机酸（97种）、生物碱（129种）、脂类（139种）、氨基酸及其衍生物（197种）、酚酸（232种）、黄酮类（263种）和其他代谢物（122种）(图2A)。研究结果表明，氨基酸及其衍生物、酚酸、类黄酮和脂类是样品中最主要的非挥发性代谢物。此外，我们还进行了 PCA 分析，探索四种抹茶之间非挥发性代谢物特征的总体差异。得分图清楚地显示了4种抹茶之间的巨大差异（图 2B）。热图（图 2C）对这种差异进行了部分阐释。
图2 四种抹茶中代谢物的分类、层次聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）。(A)抹茶样品中1383 种代谢物的分类；(B) PCA 评分图；(C) 代谢物的 HCA 图。注：Oku：晚绿；LJ43：龙井 43；ZC108：中茶 108；EC1：鄂茶 1号。
3.2四种抹茶的非挥发性代谢物的差异表征
为了更深入地了解四种抹茶之间非挥发性化合物的差异，我们采用VIP≥1和FC≥2或≤0.5的标准来筛选Oku与LJ43、ZC108、EC1之间的差异代谢物(图3A，表S3)。结果显示，各比较组中差异代谢物的数量不同：Oku vs LJ43(共297种，146种上调，151种下调)，Oku vs ZC108(共306种，155种上调，151种下调)和Oku vs EC1(共413种，165种上调，248种下调)(图3A)。值得注意的是，我们在EC1中观察到的代谢物差异最为显著，这表明在3个品种中，EC1与Oku的抹茶品质差异最大。韦恩图(图3B)表明，在各比较组中， EC1 、ZC108和LJ43中分别有169、74、49种独有代谢物。此外，在三个比较组*共中**有代谢物128种，其中，上调代谢物49种，下调代谢物76种，3种代谢物表现出不同的趋势(图3C)。值得注意的是，在共有代谢物中，黄酮类和酚酸类占了很大一部分，占共有代谢物总量的60.9%。
图3 四种抹茶非挥发性代谢物差异分析。(A)火山图中，上调的代谢物用红点表示，下调的代谢物用绿点表示;(B)韦恩图显示了三个比较组中鉴定的差异代谢物的数量;(C) Oku vs LJ43、Oku vs ZC108和Oku vs EC1*共中**同上调和下调的差异代谢物数量。
3.3 不同抹茶的关键代谢物差异
根据倍数变化阈值≥5或≤0.2，我们共鉴定出177种具有显著变化的非挥发性物质，主要属于生物碱、酚酸、类黄酮、木脂素和香豆素以及单宁类代谢产物，这些化合物对抹茶的特性至关重要(表S4，图4)。值得注意的是，代谢产物槲皮素-5- O -葡萄糖酸苷、开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷和茶黄素A在LJ43、ZC108和EC1中的含量较高。
类黄酮化合物不仅对茶叶的口感质量至关重要，而且对茶叶的着色也至关重要。本研究将63种差异类黄酮成分分为5个亚类，即黄酮醇类(35种)、黄酮类(20种)、二氢黄酮醇类(4种)、黄烷醇类(3种)和花青素类(1种)(表S3，图4A)。Oku和LJ43中差异黄酮醇数量最多，且含量高于ZC108和EC1。黄酮醇主要以糖苷的形式存在于茶叶中，是绿茶茶汤呈现黄绿色的原因之一，它们还赋予了茶汤一种柔和的涩味，还可以增强咖啡因的苦味。在ZC108中，含量较高的类黄酮有13种，其中有7种属于黄酮类，表明黄酮类成分对ZC108抹茶品质具有重要作用。三种黄烷醇：表没食子儿茶素-3-O-(3,5-O-二甲基)没食子酸酯和表儿茶素-3-(3’-O-甲基)没食子酸酯含量在Oku中较高，而没食子儿茶素-(4α→8)-没食子儿茶素含量在LJ43较高。花青素-3-O-葡萄糖苷与植物提取物的红色有关。值得注意的是，花青素-3-O葡萄糖苷是唯一的差异花青素成分，其在EC1中的含量较高，从而形成了其茶汤颜色。
酚酸可以增强茶汤的鲜味，在形成抹茶的典型味道方面发挥着重要作用。在本研究中，29种差异酚酸代谢物含量在Oku中明显较高(图4B)，占差异酚酸总量的72.5%，包括莽草酸、奎尼酸和没食子酸，以及几种酚酸葡萄糖苷和酚酸甲酯。邻苯三酚仅在LJ43中含量较低，而3-没食子酰基奎宁酸和苯甲酸在ZC108中含量相对较低。EC1中双没食子酸甲酯和4,6-(S)- 六羟基联苯二甲酰基-β-D-葡萄糖的含量尤其低。
生物碱广泛存在于茶、可可、咖啡等饮料植物中。我们共鉴定出10种差异生物碱类代谢物，它们主要属于酚胺类(图4C)。Oku中生物碱代谢物水平总体较高，但N-p-香豆酰-N’-微叶猪毛菜碱水平较其他3个品种低。吲哚是日本抹茶的关键香气成分，可能是评估煎茶整体质量的潜在标志。在EC1中，吲哚及其衍生物氧化吲哚和3-吲哚乙酸显著降低。
前期研究表明，单宁含量高不利于绿茶的贮藏。在本研究中我们鉴定了10种差异单宁代谢物。大多数单宁在Oku和ZC108中含量较高 (图4D)，表明对这两种抹茶应该采用更严格的保存方法。
“甜”一词指的是一种令人愉悦的浓郁风味，香豆素因其芳香的甜味特征而有助于绿茶的甜味品质。与上述代谢物不同的是，木脂素和香豆素类成分主要在EC1中含量较高，包括5种香豆素和2种木脂素(图4E)，这些化合物可能有助于EC1中香气的形成。
图4 (A)黄酮类化合物，(B)酚酸，(C)生物碱，(D)单宁，(E)木脂素和香豆素的热图。绿色和红色部分分别表示低丰度和高丰度的代谢物。
此外，在四种抹茶中，有4种氨基酸及其衍生物、4种萜类、4种有机酸和5种脂类成分的含量存在显著差异(表S3)。氨基酸及其衍生物，包括肌氨酸，在Oku中显示出较高的水平，与Oku相比， ZC108中的N-乙酰-L-色氨酸和EC1中的L-赖氨酸-丁酸含量增加了5倍以上。脂质可以参与Streker降解反应，产生新的风味化合物，其中一些可能是香气的重要前体，如α-亚麻酸。在4种抹茶中，与Oku相比，脂质成分1-stearidonoyl-glycerol、2-α-linolenoyl-glycerol, 1-α-linolenoyl-glycerol以及3种萜类化合物在LJ43、ZC108和EC1中均降低。相比之下，LJ43和EC1中的4种有机酸的FC值都较低。与Oku相比，ZC108中的苯*酮丙**酸、3-羟基丁酸和丙二酸含量差异不显著。
在Oku与LJ43、ZC108和EC1比较中，根据Log2FC的极大值和极小值，我们分别筛选出各比较组中排名前10 的上、下调非挥发性化合物(图S1)。在LJ43、ZC108和EC1的上调代谢物中，有4种相同的化合物：茶黄素-3-没食子酸酯、亚麻木酚素、槲皮素- 5 - O -葡萄糖醛酸苷和3-甲基-1-戊醇。在LJ43和ZC108中有3种相同代谢产物3-O-乙酰短叶松素、抗坏血酸、杨梅苷。在ZC108和EC1中只有1种相同的下调代谢物(*奈山**酚-3-O-(6′-没食子酰)葡萄糖苷)。
3.4 感官评分、色泽质量和显著代谢物的相关性分析
抹茶和茶汤色泽鲜绿，亮度高，口感和香气诱人，在提高消费者接受度方面得到了广泛认可。为了建立代谢物与这些品质属性之间的联系，我们进行了涉及感官评价分数、色泽质量和重要代谢物的相关性分析(图S2)。根据Pearson相关系数(r)的热图，我们将指标分为三类。第一类由外观、茶汤颜色和香气三个指标组成，它们与4种酚酸(5-O-咖啡酰莽草酸、乙酸苯酯、对羟基苯乙酮和5-葡萄糖氧基-2-羟基苯甲酸甲酯)和1种类黄酮(香橙素-7-O-葡萄糖苷)呈高度正相关(r > 0.90)；而类胡萝卜素、TEC、TAC和表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)与这三个指标呈显著负相关。第二类由味道, L(粉末亮度)，b(粉末黄色度)和L(茶汤亮度)四个指标组成，这组指标与部分糖类、木脂素、香豆素、茶多酚、表没食子儿茶素、槲皮素-3-O- sulfonate、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷呈显著负相关；具有苦味和涩味特性的茶多酚与味觉评分呈负相关。在水稻中，花青素-3-O-葡萄糖苷倾向于在深紫色种子而不是棕色或白色种子中积累。结果表明，花青素-3-O-葡萄糖苷对抹茶外观的亮度和茶汤颜色有负面影响。第三类由a(粉末)、a(茶汤)和b(茶汤) 三个指标组成，它们与茶多酚、类胡萝卜素、EGC、TAC、香豆素、L-赖氨酸-丁酸、8种类黄酮、5种香豆素和7种糖类成分呈显著正相关，与酚酸类物质，如乙酸苯酯、5-O-咖啡酰莽草酸、4-甲氧基肉桂酸等呈显著负相关。在该类中，a(粉末)和a(茶汤)之间呈正相关，这表明某些影响外观和茶汤色泽的化合物可能是一致的。
3.5 差异代谢物的KEGG分析
KEGG数据库可以提供代谢物积累的生物学途径信息。KEGG分析显示，在Oku vs LJ43、Oku vs ZC108和Oku vs EC1比较中，差异代谢物分别涉及67、53和79条KEGG通路(表S3)。20个低 P 值的KEGG通路的差异丰度(DA)得分如图S3所示。结果表明：在Oku vs LJ43和Oku vs ZC108之间，与黄酮和黄酮醇生物合成相关的代谢过程显著富集( P < 0.05)并上调。黄酮和黄酮醇是绿茶茶汤呈现黄色的主要原因。在这3个比较组中，光合作用途径均被下调，这与Oku的叶绿素含量高于LJ43、ZC108和EC1一致。在Oku vs EC1比较中，维生素B6代谢、光合作用、花青素生物合成和糖酵解/糖异生等代谢途径显著富集( P < 0.05)。在Oku vs EC1比较中，花青素生物合成的表达显著上调。花青素是植物中的一类天然水溶性色素，在组织中呈现粉紫色。花青素的大量积累不仅使茶叶呈现紫色，而且大大增强了茶叶的苦味。因此，EC1中花青素生物合成的上调可能对茶汤的亮度(表S2)和“苦”味特性(表S1)起着至关重要的作用。
4.四种抹茶挥发性有机化合物(VOCs)的变化
4.1 从四种抹茶中鉴定出挥发性有机化合物
我们共检测到488种VOCs，其中大部分化合物均存在于所有样品中(表S1)，包括杂环化合物（97种）、萜类化合物（82种）、酯类化合物（76种）、烃类化合物（49种）、酮类化合物（39种）、醇类化合物（39种）、醛类化合物（38种）、芳烃类化合物（29种）、苯酚类化合物（8种）、胺类化合物（8种）、酸类化合物（7种）、含氮化合物（6种）、含硫化合物（4种）、卤化烃（2种）、醚类化合物（1种）和其他化合物（3种）(图4A)，其中杂环化合物、萜类、酯类化合物占总VOCs的52.2%。与Oku (161.88 μg/g)相比，LJ43 (138.16 μg/g)、ZC108 (121.83 μg/g)和EC1 (122.43 μg/g)挥发物总含量显著降低(图4A)。为了进一步研究VOCs组成，我们还分析了不同种类的挥发物的分布(图4B)。LJ43、ZC108和EC1的醛酮含量显著低于Oku。此外，大多数VOCs类别的比例在LJ43和ZC108之间没有显著差异，这与PCA(图4B)和PLS-DA(图4C)的结果一致，LJ43和ZC108彼此紧密聚集。然而，在Oku vs LJ43和Oku vs ZC108之间，上调和下调VOCs存在显著差异(图S5D)。为了识别VOCs的关键变化，我们从PLS-DA模型中引入VIP > 1的标准，筛选出194种关键VOCs。这些挥发性有机化合物大多聚在不同的类别中，如杂环化合物、酯类、萜类、碳氢化合物、酮类、醇类和醛类(表S6)(图5和图6)。
图5 四个抹茶品种中VOC的多元统计分析。(A) 已识别挥发性有机化合物的分类；(B)主成分分析（PCA）；(C)PLS-DA得分图；(D)Oku_vs_LJ43、Oku_vs_ZC108和Oku_vs_EC1中的VOC分别上调和下调。
图6 四个抹茶品种中不同类别挥发物的相对含量（A）和比例（B）。同一颜色纵列内共享相同字母的值没有显着差异 (p < 0.05)。所有值代表四个茶样品的平均值±SD。
4.2 四种抹茶的主要香气活性挥发物
挥发性成分对茶叶整体香气的影响不仅取决于挥发性有机化合物的含量和数量，还与气味阈值有关。因此，我们利用气味活性值(OAV)对4种抹茶的关键挥发性有机化合物进行了更深入的研究。参考前期研究中建立的气味阈值，在本研究中，共有195种挥发性有机化合物被确定为潜在的芳香活性化合物，其中97种(OAV > 1.0)可能在不同抹茶的香气形成中发挥关键作用(表S7)。醛类化合物占比最高，达19.6%。醛与特定香气的形成密切相关；例如，脂肪醛主要赋予浓郁的果香味，通常伴随着类似面包香的气味。在本研究中，6种脂肪醛（反式-2-壬烯醛、正-4-庚烯醛、反式-6-壬烯醛、2-壬烯醛、庚醛和正癸醛)在抹茶中表现出较高的OAV值。
通过比较，4种抹茶中OAV均超过100的主要挥发性有机化合物主要为醛类化合物(6种)、杂环化合物(5种)、酮类化合物(3种)、萜类化合物(2种)、含氮化合物(1种)、酚类化合物(1种)、酯类化合物(1种)和醇类化合物(1种)等20种，其中具有脂肪香和甜香的(E)-2-壬醛(0.08 μg/kg)阈值较低，OAV值最高(13,055 ~ 14,598)，紧随其后的是(Z)-4-庚烯醛(OAV: 4655-7943)和呋喃醇(OAV: 3789-4195)，这三种化合物似乎在抹茶独特的“海苔味”品质中发挥了关键作用。此外，2,2,6-三甲基环己酮、3-辛烯-2-酮、二氢猕猴桃内酯、己醛、(E,E)-2,4-十一烷二烯醛、1-辛烯-3-醇、1-壬醇和乙酸酯-4-己烯- 1-醇等化合物在Oku中表现出较高的OAV。例如，3,5-辛二烯-2-酮的OAV值分别是LJ43、ZC108和EC1的6.0倍、8.9倍和13.1倍。同样，具有麝香或香豆素气味的二氢猕猴桃内酯在Oku中的OAV值分别是LJ43、ZC108和EC1的5.5倍、8.7倍和8.5倍，表明这些化合物有助于抹茶独特的清鲜和海苔味特征形成。
结论
在本研究中，我们采用UPLC MS/MS和GC-MS技术对四种不同茶叶品种的抹茶进行了挥发性和非挥发性代谢物的综合分析，共检测到177种具有显著变化的非挥发性化合物，主要包括类黄酮、酚酸、生物碱、单宁、木脂素和香豆素代谢物类物质。此外，我们筛选到97种关键香气活性化合物(OAV > 1.0)，其中醛类化合物所占比例最大，为19.6%，说明它们对抹茶香气品质的形成具有重要作用。本研究强调了品种对抹茶中挥发性和非挥发性代谢物组成的影响，还需深入研究抹茶加工过程中味道、风味和香气成分的动态变化。