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奶牛乳房炎（Mastitis）是奶牛最常发生和治疗费用最高的疾病之一。

研究表明，我国约90%的奶牛乳房炎是由大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）和链球菌（Streptococcus）引起的，而大肠杆菌被认为是临床型奶牛乳房炎的首要致病菌。

大肠杆菌入侵奶牛乳房不仅会引发乳房炎，导致产奶量和乳品质下降，甚至可能引起牛乳房的化脓性坏死，永久失去泌乳功能。

大肠杆菌引发的乳房炎一般为急性表现，临床症状明显，治愈率低，给养殖业带来巨大的经济损失。

目前，对于奶牛乳房炎的治疗主要还是使用抗生素，但抗生素的滥用，造成乳汁中药物残留及耐药菌株増加，一方面使乳房炎的治疗效果大大下降，同时抗生素过敏、细菌耐药性等问题对人类的健康也造成严重影响。

耐药、甚至多重耐药，至今没有较好的解决办法，为了减少动物的抗生素使用，增强动物免疫是重要的手段之一，疫苗的研发使用在人病兽防领域的应用中也越来越重要。

奶牛乳房炎疫苗具有安全、高效、无残留特点，因此，应用疫苗预防奶牛乳房炎成为国内外学者研究的热点，但至今未研发出理想的奶牛乳房炎疫苗。

欧美国家的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌乳房炎灭活疫苗业已上市多年，然而我国迄今仍没有乳房炎疫苗面世，究其原因，除了细菌血清型复杂造成疫苗难于研发之外，我国目前还没有适用于评价奶牛乳房炎不同疫苗效力的动物模型。

尽管也有奶山羊、家兔和小鼠大肠杆菌乳房炎模型的报道，但均没有稳定的、可重复的模型用于乳房炎疫苗研发实践，造成商业化疫苗研发的迟滞。

本研究从不同地区采集患临床乳房炎病牛乳样进行细菌分离鉴定、筛选到导致小鼠死亡而奶牛也出现典型乳房炎症状的大肠杆菌LZ06株（血清型O6），建立了稳定可靠的奶牛乳房炎模型，为课题组“奶牛乳房炎大肠杆菌基因工程灭活疫苗”临床前和临床试验研究奠定了基础，也为“人病兽防”提供了可行的研究对象。

雌性Balb/c小鼠，6—8周龄，体重20—22 g,SPF级，购于斯贝福生物技术有限公司。

健康易感奶牛，2—6岁，处于泌乳后期，分别购于内蒙古赤峰丰裕奶牛养殖场、土默特左旗与芳牧场。

革兰氏染色试剂盒购于北京陆桥技术有限公司；麦康凯培养基购于北京奥博星生物有限责任公司；TSA培养基和TSB培养基购于北京三药生物科技公司；大肠杆菌生化鉴定试剂盒购于天津市金章科技发展有限公司。

采集来自全国不同地区患临床型乳房炎奶牛的乳样。

样品无菌接种于麦康凯、TSA培养基，37℃培养24 h后观察细菌形态进行初筛，再将含疑似菌株的乳样划线接种于麦康凯琼脂培养基，置于37℃培养16 h。

挑取砖红色或粉红色，且呈平滑、周围圆整的疑似单菌落，转接到麦康凯培养基上，直至长出具有大肠杆菌典型特征的单一菌落。

挑取单菌落接种于TSA斜面保存。

最后通过革兰染色、纯粹性检验、生化鉴定、基因特征鉴定、血清学检测并进行传代稳定性实验，鉴定筛选毒株是否具有大肠杆菌典型特征。

将待测菌株加入含30 m L TSB培养基的100 m L、150 rpm振荡培养12 h，进行梯度稀释，不同稀释度菌液活菌计数后，腹腔注射Balb/c小鼠10只，每只0.2 m L，每组10只，连续观察14 d，计算半数致死量LD50。

优选对小鼠致病力强的且分属于不同血清型的毒株，将待测菌液梯度稀释，不同稀释度乳房内注射健康易感奶牛3头，每头1 m L，攻毒后连续观测7日，记录奶牛发病情况，粗略计算最小感染量（MID）；以此为基础，共设3个稀释度，用PBS进行2倍比稀释，每个稀释度注射健康易感奶牛3头，每头1 m L，设置攻毒前3天至攻毒后14天为观测期，记录奶牛乳房炎发病情况，确认MID。

观察奶牛发病情况：（1）消瘦、体力不支、起卧困难甚至卧槽不起或腹泻甚至水样、脓样粪便；精神差甚至精神沉郁，食欲不佳甚至不食；出现心率加快合并呼吸急促的状况；（2）攻毒的乳区出现硬结等异常；乳房出现红、肿、热等炎症症状；（3）乳汁呈现水样、血样、脓样或絮状外观异常或乳汁呈现颗粒状或糊状外观异常情况；（4）日均产奶量情况；（5）不同乳区的乳汁中检出大肠杆菌情况；（6）乳汁体细胞数检测，用DRAMINSKL MA-1体细胞计数仪检测乳汁导电率情况。

筛选出三株适用菌株为攻毒菌株，抽取健康易感奶牛共15只随机分为三组，对菌液进行活菌计数后采用乳房内注射1 MID，每头1 m L。

以攻毒前3天奶牛的各项指标为对照，观察攻毒后14天的各项指标，记录奶牛发病情况。

应用SPSS 22统计软件分析数据，定量资料呈正态分布，使用t检验和两因素析因设计资料的方差分析对数据进行分析。

P<0.05表示差异显著。

从收集的临床乳样，筛选出共27株大肠杆菌菌株，按批次分别命名为E01～E09、ESH01～ESH06、EHL01～EHL12。

对其生化鉴定、基因特征结果显示均具有大肠杆菌的典型特征。

传代稳定性研究显示各菌株E2代和E20代形态学、生化特征和基因特征稳定，且均能纯粹生长。

最后我们对27株菌株进行血清型别鉴定，显示它们涵盖了奶牛乳房炎大肠杆菌主要血清型，为建立奶牛乳房炎模型和研发奶牛乳房炎疫苗提供了物质基础。

采用腹腔注射的方法对分离到的27株菌进行小鼠致病性试验，显示其均对小鼠有致死性。

根据各菌株LD50结果，编号为E02、E06、E07、ESH03、ESH05、EHL03、EHL06、EHL11、EHL12株相对于其他菌株对小鼠致病性更强。

挑选在小鼠中致病力强的且分属于不同血清型的菌株E02、E06、E07、ESH03、ESH05、EHL03、EHL06、EHL11、EHL12，采用乳导管内注射的方法对奶牛致病性进行研究，测量菌株MID，并攻击健康易感奶牛，攻毒后检测各组奶牛乳房炎的发病情况。

E06、ESH05和EHL11菌株对小鼠致病性强；对奶牛也能引起典型乳房炎症状，泌乳量减少40%左右，乳汁体细胞数下降，细菌数升高，肉眼可见乳汁颗粒状或糊状变化，奶牛精神差，食欲不佳，至观察期结束仍未完全恢复至正常水平。

其他菌株对奶牛无致病性，各项指标均在正常范围（E02、EHL03、EHL06），或致病性不稳定（E07、EHL12）。

选取E06株、ESH05株和EHL11株作为攻毒菌株，且MID均为103CFU。

E06株血清型为O6，基因特征符合要求，对小鼠和奶牛均有较强的致病性，故首先选用E06菌株作为评价灭活疫苗的强毒株并建立奶牛乳房炎动物模型，按其产地和编号命名为大肠杆菌LZ06强毒株，其余两株作为备选。

大肠杆菌强毒株LZ06(O6）株、ESH05(O8）株、EHL11(O81）株乳导管内注射1000CFU，各接种5头健康易感奶牛。

从攻毒前3天，至攻毒后14天，连续观测17日，结果如下：

与健康奶牛相比，接种后第1天各攻毒组均出现精神差、食欲不振、消瘦、体温升高、心率加快呼吸急促等奶牛乳房炎的典型临床症状，极少数在第6天出现起卧困难等严重症状，但均在第7—8天得到缓解，大多数个体第9天后临床表现恢复正常。

乳房局部炎症症状也起自接种后第1天，多数奶牛第5—6天乳区出现硬结，第8天乳区全部恢复正常。

与攻毒前相比，接种后第1天所有奶牛乳汁均出现颗粒样或糊样，部分奶牛在后续病程中出现水样、絮样、血样和脓样乳汁，于第9—10天后恢复正常。

与攻毒前的产奶量相比，三组中任一时间点均出现显著的产奶量降低（P<0.05）。

接种后第1天，三个攻毒组即出现日产奶量与接种前3天产奶量均值的百分比均显著低于40%，并在之后的3天持续降低。

从第4天开始进入快速恢复期。

至第6天ESHO5组和EHL11组恢复至原产奶量的40%,LZ06组第7天恢复至原产奶量的40%。

第8—14天三组进入缓慢恢复期，但至观察期结束，三组均没有恢复至攻毒前产奶量的90%。

两因素析因设计资料的方差分析显示，LZ06组日产奶量百分比显著低于ESH05和EHL11组，差异显著（P<0.05),ESHO5和EHL11组间差异不显著（P>0.05）。