1. 定义

1.问题的提出

硬且有一定韧性的结缔组织，主要由大量钙化的细胞间质和多种细胞组成。而这种钙化的细胞间质又称为骨基质，主要包括有机质和无机质。其次，骨组织作为一种高度动态的组织，多种细胞类型在矿化基质中以协调的方式共同作用。正常情况下骨组织可以从损伤组织中再生形成新生的骨组织。在骨重塑过程中，这取决于骨形成与骨吸收之间的密切联系。骨骼的吸收-生成是通过严格的信号控制来维持骨骼内部的稳定性。当骨折发生时，若骨吸收-形成过程无法与骨损伤达到平衡状态，这会导致骨骼结构/功能的丧失，因此需要外界的协同治疗来恢复平衡。目前，在临床实践中，骨缺损的治疗手段一般采用具有良好生物相容性的活性材料，诱导成骨分化，以此促进骨愈合。

骨质疏松症是一种由破骨细胞和成骨细胞的不平衡导致骨量减少和骨微结构退化而引起的骨骼疾病。由骨质疏松症引起的骨量减少和骨组织退化，会大大增加骨脆性和骨折的风险。这种疾病通常发生在脊柱、髋关节和腕关节，每年约有900万例新骨折病例，影响着全世界数百万人的骨骼脆弱性和骨折风险。钛及其合金具有耐腐蚀、机械性和生物相容性好的特点，已被广泛应用于生物医学临床领域，如硬组织修复和关节置换的人工植入物。随着植入物的高成功率和骨融合的巨大潜力，钛基植入物现在已经成为无牙修复的基石。然而，钛基植入物具有的生物惰性表面，导致与骨组织整合能力低。钛种植体主要是利用物理嵌合法与体内结合，若周期过长，会带来稳定性差、容易松动或脱落的风险。

钛及其合金具有耐腐蚀、机械性和生物相容性好的特点，已被广泛应用于生物医学临床领域，如硬组织修复和关节置换的人工植入物。随着植入物的高成功率和骨融合的巨大潜力，钛基植入物现在已经成为无牙修复的基石。然而，钛基植入物具有的生物惰性表面，导致与骨组织整合能力低。钛种植体主要是利用物理嵌合法与体内结合，若周期过长，会带来稳定性差、容易松动或脱落的风险。此外，钛种植体的热膨胀系数与骨之间存在差异，这也会导致钛种植体与骨之间粘结不稳定。值得注意的是，在骨质疏松症等某些疾病的影响下，Ti植入物的骨整合潜力会受到严重限制。

主要有两个原因，首先在骨质疏松症的病理条件下，骨质疏松症会减少骨量，降低骨祖细胞的数量和活性，增加骨折的风险，并延长愈合过程。在种植体愈合的情况下，骨和种植体之间的可用接触面减少，而骨细胞的数量和质量受损阻碍了种植体的骨整合，使得增加钛表面细胞附着的常规方法获得的功效有限。其次，骨质疏松症伴有持续的炎症，这会破坏局部骨免疫平衡，进一步破坏骨植入体的整合并损害伤口愈合。因此，增强周围组织中的骨细胞活性和骨基质沉积，以及协调其他类型的修复细胞，来改善骨植入体的整合就显得至关重要。

由于在骨质疏松的情况下，很难建立理想的骨-植入体结构连接（“骨结合”）。因此，如何有效地构建具备调控病理微环境的种植体表界面，并促进骨整合是生物医用材料领域亟待解决的问题。

2.炎性骨质疏松症

已知，骨质疏松症的常见病症主要表现为原发性骨质疏松症与继发性骨质疏松症两种。其中原发性骨质疏松症又分为绝经后和老年性骨质疏松症两类。

1. 绝经后骨质疏松症（主要为第一阶段）是“高骨周转”，小梁骨流失迅速发生。破骨吸收大于骨形成；
2. 老年性骨质疏松症(或绝经后骨质疏松症的第二阶段)主要表现是皮质骨和小梁骨减少，此阶段称为骨缓慢周转期。其主要机制是指再吸收腔增加，不完全闭合的骨堆积也导致孔隙度增加以及骨细胞数量和骨细胞网络连接的恶化。而继发性骨质疏松症的主要原因是由于某些疾病（内分泌性代谢疾病、结缔组织疾病、肾脏疾病以及消化道等疾病）或药物等原因导致骨量减少、骨组织遭到破坏、骨脆性和骨折风险增加的一种疾病。比如：糖皮质激素诱导的骨质疏松症中，表现为骨吸收量增加和骨形成量减少。而在炎性骨质疏松症中，骨质流失主要表现为破骨细胞活性增强和成骨细胞活性减弱。

骨骼形成是脊椎动物的终身过程，它由骨骼内成骨细胞的骨形成和骨吸收之间的平衡所决定。当平衡被破坏时，会引起慢性炎症疾病的发生，导致异常骨质流失和骨质疏松性骨折。有研究报道，在慢性炎症过程中，骨丢失的主要原因是因为促炎细胞因子增加后，可以促进破骨细胞或抑制成骨细胞的分化。其次，最近的数据显示，某些类型的免疫细胞，包括T细胞，B细胞和巨噬细胞均参与骨质疏松症的发病机制。而炎症骨质疏松症活性巨噬细胞可以分泌多种诱发骨质疏松和骨质流失相关的炎症性细胞因子，它破坏局部骨免疫平衡，进一步破坏骨植入整合，损害伤口愈合[36]。临床接受种植体修复的患者多为中老年人，与骨质疏松症患者高度重叠。因此，调节巨噬细胞活性，以降低炎症性细胞因子来抑制相关促炎活动，在预防炎症引起的骨质疏松症方面很有希望。

1. 黄芩素功能化钛/锶微纳结构界面的制备与表征

目前，钛材因其优良的耐腐蚀性、机械性能和生物相容性，在生物医药中得到了广泛的应用。但是，由于其具有高的界面惰性和低的生物活性，使其在临床上的应用受到很大的限制。骨质疏松症的病理微环境（如炎性微环境）进一步降低钛植入体手术的成功率。因此，在钛基材表面构建一个良好的药物递送界面成为治疗炎性骨质疏松性骨折的一种有效途径。炎症骨质疏松症中活性巨噬细胞可以分泌多种诱发骨质疏松和骨质流失相关的炎症性细胞因子，它破坏局部骨免疫平衡，进一步破坏骨植入整合。因此，利用材料界面调节巨噬细胞活性，实现骨形成和骨抑制之间的平衡而促进植入体骨整合对治疗炎症骨质疏松骨折具有潜在的优势。

据报道，丝素蛋白（SF）因具有优异的生物相容性和生物可降解性，而被广泛应用于在再生医学应用领域。据报道，丝素蛋白具有良好的招募特性，巨噬细胞迁移到伤口部位，促进细胞黏附和生长，不会引起显著的炎症。

1. 汉黄芩素功能化钛/锶微纳结构界面RAW264.7细胞的生物学响应

炎症控制是控制慢性伤口愈合的关键，慢性伤口愈合需要在正常伤口愈合所需的早期炎症和导致慢性愈合的过度炎症之间实现微妙的平衡。巨噬细胞是重要的炎症细胞，在许多方面发挥作用，包括介导先天免疫过程、吞噬凋亡细胞，以及在伤口愈合过程中分泌细胞因子或生长因子。巨噬细胞的动态可塑性使其自身能够调节组织破坏和修复，而M1型巨噬细胞可以分泌促炎细胞因子，M2型巨噬细胞可以通过分泌抗炎细胞因子和生长因子来调节炎症、血管重建和诱导组织再生。

巨噬细胞存在于组织-种植界面，介导异物反应，分泌多种促炎和抗炎细胞因子，在愈合过程中动态调节骨免疫环境。在骨愈合的早期，某些促炎细胞因子对于启动骨-植体整合以及随后的创面愈合至关重要，其中具有招募修复细胞、启动血管生成、诱导成骨的功能。之后，巨噬细胞停止释放炎症信号，开始分泌其他促进血管形成、组织基质重构和局部免疫平衡的细胞因子。这种关闭应及时发生，因为过早或延迟的开关都会妨碍愈合。此外，在骨质疏松的病理过程中，巨噬细胞的活动不同于正常情况下，炎症的解决尤为重要。

过度骨吸收NF-κB受体激活剂的配体和其他刺激可以诱发巨噬细胞极化,进而恶化炎性基因。针对这一需求，一种能够在正确的方向激活炎症，然后在正确的时间使其失效的种植体表面，代表了一种增强骨-种植体整合和组织愈合的有前途的策略。

四、汉黄芩素功能化钛/锶植入体的体内抗炎促成骨效应

免疫细胞与骨骼系统相互作用，并在损伤后愈合反应中发挥重要作用。骨损伤修复分为三个阶段：炎症反应期、修复期和骨修复期。在炎症初期，炎症在骨损伤后24小时达到高峰，其特征是促炎细胞因子、抗炎因子和促进早期血管生成的因子的表达为下一步的新骨和血管生成提供一个有利的微环境。损伤后7-10天是一个更新期，炎症反应会逐渐过渡到修复阶段。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨修复阶段被招募到损伤部位，通过分泌形成骨基质并逐渐矿化形成新骨以参与骨代谢的调节。最后在骨修复阶段形成新生的骨组织。但是这样的自然骨愈合无法完全修复显著性的骨折缺损，而在炎症初期，促炎因子的大量分泌，破坏了体内微环境中促炎因子与抗炎因子的动态平衡状态，进一步干扰了骨损伤的愈合过程，导致骨愈合不理想。

五、结论

本研究中，利用微弧氧化及电化学沉积技术在钛材表面生成锶掺杂纳米孔结构（Ti-MAO/Sr），并利用LBL技术将负载汉黄芩素的丝素蛋白纳米颗粒（WNP）多层膜引入到Ti-MAO/Sr，得到Ti-MAO/Sr/LBLWNP。该植入体可有效调控功能分子汉黄芩素及Sr离子的持续释放。汉黄芩素是一种抗炎药物，除了降低促炎性的表达以外，还可以调控巨噬细胞的表型，促进巨噬细胞向M2表型转化并分泌一些抗炎性因子，通过旁分泌机制可以显著提高成骨细胞的骨分化水平。与此同时，Sr离子是一种寻骨元素，对促进骨形成和抑制骨吸收有显著作用，也协同促进了整体的成骨细胞的成骨分化作用。Ti-MAO/Sr/LBLWNP植入大鼠（股骨部位）后，发现显著提高了植入体周围新生骨的生成。

主要结论如下：

①SEM、水动力学尺寸和Zeta电位等表征结果表明，利用天然丝素蛋白制备的负载药物汉黄芩素的纳米颗粒，其平均粒径为180nm，大小分布均匀。SFNPs的Zeta电位大约在-12mV左右,加入汉黄芩素后，WNP纳米颗粒的Zeta电位大约在-30mV左右，证明汉黄芩素被包覆在丝素蛋白纳米颗粒中。

②SEM、EDS、AFM、XRD、XPS及荧光检测等表征证明，利用微弧氧化及电化学沉积技术在钛材表面生成锶掺杂纳米孔结构（Ti-MAO/Sr），并利用LBL技术成功将负载汉黄芩素的丝素蛋白纳米颗粒(WNP)多层膜引入到Ti-MAO/Sr，得到Ti-MAO/Sr/LBLWNP，且材料具有一定稳定性。

③细胞实验CLSM和CCK-8等结果表明，所设计的汉黄芩素功能化钛/锶微纳结构材料对于巨噬细胞和成骨细胞都有良好的生物相容性，且无基本毒性，细胞铺展状态良好，对巨噬细胞和成骨细胞在材料表面的粘附、增殖和分化有显著的促进作用。

④通过细胞免疫荧光实验、ELISA检测实验、qRT-PCR实验、ALP活性检测和矿化等实验的定量和定性分析结果，验证了Ti-MAO/Sr/LBLWNP材料对巨噬细胞有良好的体外抗炎作用，并可以将活性巨噬细胞由M1型极化为M2型巨噬细胞，其旁分泌机制还表现出了对成骨细胞的生长增殖及成骨分化的促进作用。

⑤利用免疫荧光染色实验对骨质疏松骨缺损模型修复的植入体组织周围新生骨面积进行探究，结果表明：与体外实验结果相符，该材料不仅具有良好的免疫调控作用还对骨组织再生有显著的促进作用。