文/墨茶
编辑/墨
烟曲霉菌是目前公认的最主要的呼吸道病原菌，约90%的病原菌由其引起。近年来，我国的条件性霉菌感染呈显著增长。阐明其致病机理，对其防治具有重要意义。细胞壁是一种特殊的生物膜，对宿主有很强的防护能力，且与宿主有很大的不同，因而被认为是一种新型的抗真菌药物。
烟曲霉细胞壁结构研究进展
1.烟曲霉细胞壁结构
烟曲霉菌的细胞壁约有30%的总重量，它的90%是由多种糖链以共价键方式连接在一起而构成的，含有大量糖链和糖链。研究结果显示，在烟曲霉的细胞壁中，有两种物质，一种是几丁质，另一种是半乳甘露聚糖，它们是以β-1,4和α-1,6键与beta1,3-葡聚糖的非还原端相连，beta1,6分支的beta1,3-葡聚糖与几丁质的结合，构成了一个核心结构，它是细胞骨架的内纤维层。
同时，它也是细胞外周物质的重要组成部分，使菌丝体能够形成一种对抗生素具有耐药性的生物被膜。在酿酒酵母中，beta-1,6分支的beta-1,3-glucose和几丁质共同影响着菌体的硬度，而beta-1,3-glucose影响着菌体的流动性。
将烟曲霉的细胞壁结构与其它真菌和酵母进行对比，发现它们之间既存在着一些相似之处，也存在着一些差异 ：分支的beta-1,3-葡聚糖是除酿酒酵母之外的其他真菌都具有的一种共同的结构，但是在啤酒酵母中没有几丁质，而且啤酒酵母也不包含由alpha-1,3-葡聚糖构成的非晶态成分。
从烟曲霉菌中发现的5个半乳呋喃糖中含有较短的一条侧链，代替了酿酒酵母中的一条侧链。在此基础上，研究了多糖基化修饰对多糖膜硬度的影响。它们涉及到alpha,beta-1,3-葡聚糖，几丁质，半乳甘露聚糖，N-,O-甘露聚糖的合成。
2.细胞壁药物靶点
目前，将其作为抗肿瘤药物作用的分子机制已得到广泛关注。 已有报道表明，该菌的细胞壁结构发生了改变，从而对其致病性产生了一定的影响。
1,3-葡聚糖合酶基因的敲除突变体可使*草烟**曲霉的毒性增强，并可能与其促进了黑素的生成有关；另一方面，半乳呋喃糖苷的敲除导致突变体的细胞壁变薄，导致其对烟曲霉菌的耐药能力显著增强，并且在入侵性曲霉菌感染（IA）中显著下降。另外，与野生型相比，几丁质合酶敲除后，致病性明显降低。
目前，以尼克霉素为靶标的靶向抗菌药物研究已成为研究热点。其中，棘白菌素类卡泊芬净是一种基于真菌细胞壁上的beta-1,3-葡聚糖（beta-1,3-葡聚糖）为靶标而开发的一种新型抗病原真菌药，因为在动物的细胞上没有细胞壁，所以它的特异性高于两性霉素B、伊曲康唑等，并且没有细胞毒性。 另外，卡泊芬净在破坏了细胞壁的同时，也促进了两种药物对细胞膜的影响，所以这两种药物一般都是联合使用。
我们前期研究表明，卡泊芬净可引起真菌beta-1,3-葡聚糖含量下降，甲壳素含量升高，并伴随着芽孢杆状分叉、细胞壁活性位点断裂等形态变化，并出现了在芽孢杆尖、分叉处的膜脱极现象。
在治疗过程中，以卡泊芬净为代表的棘白菌素对肾脏的损害较小，但会导致肝脏的损害，血液中的胆红素升高，严重的肝脏损害时应停止使用。尼克霉素Z为UDP-N-乙酰葡糖胺水解产物，具有较强的抗菌活性，尼克霉素Z作用后，曲霉菌丝体呈膨胀球状，但由于其对烟曲霉菌的抗性较差，故还没有将其用于临床。
烟曲霉GPI结构研究进展
1.GPI蛋白及功能
许多细胞壁上的蛋白质都是通过糖磷酸化磷酸肌醇酶（GPI）的翻译后修饰才被固定于细胞膜上，这种蛋白质被称为GPI锚定蛋白。 按其在细胞核内的位置可划分为两类：一类是GPI-CMP，另一类是GPI-CWP。
近年来，GPI脂类锚定蛋白（GPI）已被认为是抗真菌药物研发的一个新的研究热点。GPI锚定蛋白（GPI）是一种重要的功能蛋白，包括多种酶（如碱性磷酸酶、乙酰胆碱脂酶、5'核酸酶、肾二肽酶、碳酸酐酶等）、受体、粘附蛋白和抗体等。
2.GPI锚定结构影响细胞壁合成
与其它大部分的真核细菌一样， 在烟曲霉菌中，GPI也参与了细胞壁的形成。 Afpig-a是一种类似于Gpi3的酶促亚基，我们前期研究发现Afpig-a与Gpi3具有较高的亲缘性，其功能被证明是一种新的GPI结合蛋白，具有重要的生物学功能。
通过对Afpig-a启动子代换后的菌体进行分析，我们发现Afpig-a启动子代换后，菌体出现了细胞壁形成障碍，其特征是对细胞壁干涉物的敏感性增强，胞壁糖蛋白和beta-葡聚糖含量降低。
在该株中，由于与细胞壁合成有关的蛋白的合成增加，以及GPI锚定物的缺失，引起了植物体内的ERS应激反应。通过转录组学研究发现，GPI生物合成障碍后，其在体内大量积累，从而影响其生物合成，并活化其下游信号传导途径。
此外，PkcA/Pkc1可被磷酸化。我们前期研究发现，在心肌肥厚中发现，在烟曲菌中存在115种GPI锚定蛋白，它们可以被GPI锚定，但这些GPI锚定的具体机制尚不明确。
通过对烟曲霉菌膜组分的研究，我们发现在烟曲霉菌的细胞壁上存在着9个GPI锚蛋白，其中5个GPI锚蛋白与Scerevisiae的Gas,Crh,Ecm33等都是GPI锚蛋白。GPI锚定型beta-1,3-葡萄糖苷化修饰酶（gel2）是调控烟曲霉菌致病性的关键因子，gel4是调控烟曲霉菌致病性的关键因子。
与gel2相反，ecm33基因沉默后，毒力增强，孢子发芽加快，细胞壁中甲壳素含量明显增多，提示细胞壁组分变化可能是其毒力增强的重要机制。
同时，通过对几丁质合酶和糖基化修饰酶基因的分析，发现它们的生长发育与GPI锚定蛋白的表达水平有关。
上述研究表明，该基因与烟曲霉菌的细胞壁组分具有一定的相关性。 通过对4种GPI锚定蛋白的GPI结构的解析，我们发现它们的GPI磷酸化磷酸化的肌醇型神经酰胺（包括神经鞘氨醇和C24:0),GPI糖链以五甘露糖（5-3Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN）形式与葡萄糖胺结合。
基于对该菌株中与该菌株中GPI合成有关的酶系信息的搜索，并对该菌株中GPI的关键酶系进行了解析，得到了该菌株中GPI的主要酶系。上述结果提示，GPI定位的ECM不仅对ECM的生物学行为有很大影响，而且对ECM的致病性也有很大影响。
3.GPI信号定位特点
通过已有的工作表明，在该菌中，GPI是由残留的GPI分子与细胞壁相互作用而形成的。 通过对两种GPI蛋白的氨基酸序列的比较，我们得到了位于“ω-”区一边的含有大量丝、苏氨酸的氨基酸和2个碱基氨基酸对GPI蛋白的定位起着关键的影响，且二者之间的关系更为密切。
若有2个基本的氨基酸位于“ω-”边，则GPI蛋白质很有可能被固定于细胞膜，否则GPI蛋白质会被固定于细胞壁。
但是，即便有2个基本的碱基在“ω-”边，若有丝苏氨酸富集区出现，则此蛋白极有可能只出现在细胞壁上，不会出现在细胞膜上。 对于酵母GPI的分类机理，大多数学者都有了一定的认识，并且有了一定的理论依据，但对于丝状真菌的分类机理，目前还没有一个很好的认识。
最近的研究发现，植物中影响其细胞内位置的关键分子也是通过其C末端GPI的结合区域实现的。
但是，最近的工作发现，在烟曲霉菌中，GPI的定位与酵母有很大的不同，其中omega-1和omega-2两个位置上的单一碱基可以导致GPI的定位。虽然目前还没有发现与GPI结合的细胞壁蛋白AfMP1，但是它在细胞壁上的分布却与其在细胞壁上的位置无关。
基于GPI的“锚”特性，Ouyang等人建立了一种能在两种植物上同时高效地表达异源蛋白的体系（如图3）。
通过已有研究表明，GPI主要由beta葡萄糖与细胞壁形成共价键，而曲霉菌则不存在这种情况。
目前对该蛋白与葡萄糖苷酶的结合模式还不清楚，但由于其也能被氢氟酸和氢氟酸-吡啶降解， 我们推断其结合模式可能与葡萄糖苷酶类似，也可能是由剩余的GPI酶结合到葡萄糖苷酶链上形成的。
但Latge等认为，与酵母不同，该GPI蛋白只在细胞壁中发挥作用，不能通过共价结合的方式，与细胞壁中的糖链形成相互作用，从而影响细胞壁的立体网络。前期工作中，Bernard等人通过对烟曲霉菌GPI细胞壁蛋白PhoAp的研究，发现其C端没有beta-1,6-葡萄糖，且没有其它多糖的共价键合。
通过对PhoAp的基因表达谱的分析，我们认为PhoAp的高度甘露糖基化有助于其与beta-1,3-葡萄糖的相互作用。从前期研究中，我们筛选到5个与GPI蛋白AfPhoAp相互作用的CRH家族成员，并在烟曲霉中进行了功能验证。
Ouyang等人通过对GPI信号多肽的分析，证实了GPI的细胞壁蛋白AfMp1可以与细胞壁共价结合，并且AfMp1只有GPI和O两种糖基化位点，但其与细胞壁的相互作用模式尚不明确。
结语
如今，在一家医院，抗菌药的花费，是仅次于医生的花费。但目前临床上尚无准确、快捷的检测手段，且临床上尚无有效的抗病性检测手段，同时，随着病原菌对新型抗病毒药物的耐受性逐渐提高，但新型抗病毒药物研发进展缓慢，造成病死率极高。
由此可见，开发新型的抗病原菌药物仍有很长的路要走。本项目的实施，不仅可以进一步揭示细菌致病的分子机理，而且可以深化对丝状真菌GPI糖基化修饰的理解，为发现有效的治疗靶标和开发新药奠定基础。
参考文献：
1.苏建臣，欧阳浩淼，赵婉，等．里氏木霉细胞表面表达系统的构建．微生物学报
2.曲霉菌病.微生物感染，1989
3.半乳糖对病毒寿命的贡献.机会性致病菌.核细胞，2008
4.克拉沃、艾马南达等，细胞壁多糖及其生物合成论文与组织学.未来微生物学