专家述评
【专家述评】遗传性眼病致病基因突变分析中应重视临床表型的评估
李杨
100730北京，首都医科大学附属北京同仁医院 北京同仁眼科中心 北京市眼科研究所 眼科学与视觉科学北京市重点实验室
通信作者：李杨
Email：yanglibio@aliyun.com
DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2017.08.001
【摘要】一代测序（Sanger测序）技术可对候选基因进行测序分析，其测序读长较长，准确性高，是过去三四十年间常用的基因突变分析方法，但因其存在测序通量小及成本高等缺点，限制了其在具有高度遗传异质性疾病及大样本量基因突变分析中的应用。二代测序（NGS）技术是2005年以来发展起来的在临床上广泛应用的基因测序技术，测序通量高，费用较低，自动化程度高，为遗传性眼病的基因诊断带来了很大的便利。但实际上，单基因遗传性眼病具有高度遗传异质性和临床异质性，在应用NGS技术对遗传性眼病的分析过程中过度依赖基因突变分析技术而忽略患者复杂临床表型的评估可能在基因测序检测方法的选择上出现偏差，造成检测结果判断的失误或给患者带来经济负担。目前，单基因遗传性眼病基因突变分析方法主要是NGS分析结合Sanger测序验证，在此过程中应重视患者临床表型的准确评估，以确保准确选择基因检测方法和合理判定致病基因突变。
【关键词】高通量核苷酸测序/应用；分子诊断技术/方法；突变； DNA测序分析/应用；遗传性眼病; 表型
基金项目：国家自然科学基金项目（81570886）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才（学科带头人）培养计划项目（2013-2-021）
单基因遗传性眼病是一类具有高度遗传和临床异质性的致盲眼病，主要包括角膜营养不良、先天性白内障、眼前节发育异常、遗传性视网膜疾病等。对这类疾病致病基因突变分析的经典方法是首先对遗传家系致病基因进行连锁分析染色体定位，然后用一代测序（Sanger测序）对候选基因进行测序分析以确定致病基因突变。在过去的三四十年里，Sanger测序因其测序读长较长及准确性高等优势，一直是基因突变分析的主要检测方法，但其缺点是测序通量小及成本高等，限制了其在具有高度遗传异质性疾病及大样本量基因突变分析中的应用。自2005年以来，二代测序（next generation sequencing，NGS）技术应运而生，因其测序通量高、费用较低、速度快及自动化程度高等优点而得到广泛的应用[1]。近10年来国内外许多研究团队用基因定点捕获技术（targeted exome sequencing，TES）或全外显子捕获技术（whole exome sequencing，WES）结合Sanger测序等检测技术确定了大量遗传性眼病的致病基因及相应基因的大量致病突变，许多第三方生物公司乃至医院将致病基因突变分析的研究成果转化到临床，纷纷开展了遗传性眼病患者的基因诊断工作。尽管基因突变分析技术取得了飞跃式发展，但在遗传性眼病致病基因突变分析研究中及临床患者基因诊断过程中对患者临床表型的详细评估与准确诊断却不容忽视。
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准确的临床诊断可正确选择基因检测方法或检测的Panel
尽管许多单基因遗传性眼病具有遗传异质性，即不同致病基因可导致相同的临床表型，如视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）的致病基因多达80余种，但有些遗传性眼病的致病基因却比较单一，如就目前所知，先天性无虹膜的致病基因仅为PAX6，遗传性视网膜劈裂致病基因为RS1，结晶样视网膜色素变性（Bietti crystalline corneoretinal dystrophy，BCD）致病基因为CYP4V2，无脉络膜症致病基因为CHM等[2-7]。这些致病基因均较小，编码外显子均不超过20个，如RS1基因只有6个编码外显子，最大的CHM基因也只有15个编码外显子，因此对这些疾病患者致病基因突变进行分析时（无论是研究工作还是临床基因诊断）就没有必要进行相对复杂的NGS，直接用Sanger测序分析即可准确完成基因诊断，且简单、快速和方便，应作为首选的方法。在临床上，部分医生将先天性无虹膜（特别是部分无虹膜）与虹膜缺损相混淆，这2种疾病均属于眼前节发育异常，但虹膜缺损患者常伴有脉络膜缺损，而先天性无虹膜患者则可伴有先天性白内障、继发性青光眼或黄斑发育不全等，通过眼前节和眼底的详细检查即可鉴别。先天性无虹膜患者PAX6基因突变中存在一定比例基因组DNA的拷贝数异常，即1个或数个外显子，甚至整个基因的丢失或重复，由于该病为常染色体显性（autosomal dominant，AD）遗传，Sanger测序不能检查到此类突变，需要用多重链接探针扩增（multiple link probe amplification，MLPA）或实时定量PCR等方法来检测和分析[8]。本实验室前期对42例先天性无虹膜患者进行了PAX6基因直接测序，在31例患者中找到了致病突变，随后对9例基因检测结果阴性的患者进行了PAX6基因的MLPA分析，在8例患者中检测到该基因多个外显子，甚至整个基因的丢失, 检出率高达98%（41/42）。BCD患者眼底有特征性点状黄白色小结晶，与其他遗传性视网膜疾病不易混淆[5]，因此可对这些患者进行CYP4V2基因的直接Sanger测序。本实验室前期对百余例BCD患者进行了CYP4V2基因直接测序分析，全部找到了致病突变，检出率高达100%。
除上述致病基因单一的遗传性眼病外，具有遗传异质性眼病患者的临床表型评估也同样重要。WES可以检测基因组DNA所有编码基因，与致病基因目标区域捕获技术，即TES相比费用较高，另外就检测技术来说，捕获Panel中包括的基因越多，各个基因捕获覆盖的一致性就会越低，某些基因序列中高GC含量或重复序列的片段捕获深度就降低，发生在这些区域的基因突变也易遗漏[9-11]。 因此，目前在致病基因突变分析研究和临床患者基因诊断工作中大多数采用TES结合Sanger测序验证的方法。根据研究目的或疾病类型，目标区域捕获Panel所包括的基因类型和数目也各不相同，TES Panel的选择往往取决于患者的临床诊断。在临床上，有些疾病临床表型多样并且表现度不同，如视锥细胞营养不良患者早期仅表现为视力不好、视盘色淡和黄斑中心凹反光略弥散，如果未详细询问病史及进行视网膜电图（electroretinography，ERG）等检查，可能会诊断为视神经萎缩，如果用视神经萎缩相关Panel 进行基因突变分析肯定找不到相应的致病基因。本实验室前期在可疑遗传性视神经萎缩致病基因突变分析中，后期对197例检测阴性患者重新进行临床评估，发现2例患者为锥杆细胞营养不良（cone-rod dystrophy，CRD），并在后续研究中发现这2例患者均携带ABCA4致病基因突变。
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准确的临床诊断有助于致病基因突变的判定
由于大多数单基因遗传性眼病具有高度的临床和遗传异质性，即使用先进的NGS分析（无论是用TES还是WES），患者致病基因突变的检出率也只有60%~70%，如遗传性视网膜疾病，主要包括RP、脉络膜视网膜变性（chorioretinal degeneration，CRD）、Leber先天性黑朦（Leber congenital amaurosis，LCA）等 [9-11]。以目前常用的TES为例，通常研究遗传性视网膜基因的捕获Panel包括200~300个已知遗传性视网膜疾病的致病基因 (RetNet，https://sph.uth.edu/Retnet/sum-dis. htm)，每个待测患者样本通过基因组DNA建库、目标区域捕获富集和测序，测序结果进行初步生物信息学分析后，每个样本大约发现450个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和30个小的缺失或插入，这些数据再经过公共SNP数据库及自身数据库等滤过分析，最后每个样本剩下2~3个基因的5~6可疑致病基因变异[9-11]。对受检患者临床表型进行准确、全面地评估及对其家族史的正确追溯和判断对确定其致病基因突变十分重要，如果患者有明确的AD家族史，那致病基因突变肯定首选AD的致病基因，如患者父母为*亲近**婚配，则首选常染色体隐性（autosomal recessive, AR）遗传致病基因的纯合突变。但有些情况则比较复杂，某些基因的致病突变既可通过AD遗传，又可通过AR遗传的方式进行传递，如RP1基因突变既可造成ADRP，又可导致ARRP[12]。本实验室前期对1例临床诊断Usher综合征的患者进行了基因定点捕获分析，我们使用的捕获Panel包括371个遗传性眼病的致病基因，经过TES分析流程的筛选，选出6个基因的变异为可疑致病突变，均为杂合变异，其中包括3个RP的基因、1个CRD的基因和2个其他非视网膜疾病的致病基因，其中RP1的无义突变p.R1933X似乎是致病突变，在随后的家系共分离分析中发现其孪生患病弟弟携带相同突变，但迄今尚未发现RP1基因突变导致Usher综合征的报道[12]，另外患者母亲眼底检查完全正常，也携带上述相同无义突变，因此我们又对该患者最初的483个SNP进行分析，找到了1个MYO7A基因的纯合错义突变，家系共分离分析2例患者携带相同突变，而患者父母分别携带该杂合错义突变，最终确定这2例患者的致病基因是MYO7A。更为复杂的是还有一些基因的致病突变以AD传递时导致的临床表型与以AR传递时引起的临床表型不同，如GUCY2D基因的杂合错义突变导致CRD的临床表型，而纯合或复合杂合突变（主要是无义或小缺失或插入突变）则导致严重的LCA；PDE6B基因的杂合致病突变导致AD先天性静止*夜性**盲，而复合杂合或纯合突变则导致ARRP[13]。对可能携带这些基因突变患者更需要仔细进行临床表型评估及准确地判定遗传方式。另外，还有少数患者通过NGS 分析后仅找到AR致病基因的杂合突变，在这种情况下，准确的临床诊断对判断该基因是否为致病基因也很重要，关系到下一步基因分析方法的选择。例如，1例临床上诊断RP的患者经TES分析发现1个BBS2基因的无义杂合突变，BBS2基因突变导致Bardet-Biedl 综合征（Bardet- Biedl syndrome，BBS），患者除有RP的临床表型外，还可伴有肾病、肥胖、多指（趾）、发育迟缓等表型[13]。与其他遗传性视网膜病变相似，BBS患者的临床表型差别很大，一些患者除了RP和多指（趾）的临床表型外，没有上述其他的临床表型，而许多患者在出生后不久就已手术切除多指（趾），有些患者甚至不知道有该临床表型，因此在这种情况下要对患者的临床表型再次评估，如临床上诊断为BBS，就可初步推测BBS2是该患者的致病基因，另外1个突变等位基因可能是大片段缺失或重复等基因组DNA 拷贝数异常，或者NGS过程中对该基因某些区域覆盖捕获不好造成遗漏，需用Sanger测序进行补充测序查找。理论上NGS可以检测到拷贝数异常，但是由于其检出的敏感性与NGS的捕获深度和拷贝数异常的大小等因素有关，对可疑携带拷贝数异常的患者样本往往还需要用MLPA等其他方法进行分析。
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小结
总之，随着分子遗传学技术，特别是NGS技术的发展，发现了越来越多的遗传性眼病的致病基因和致病基因突变，越来越多的患者也得到了相应的基因诊断。相关的研究人员和临床工作者在遗传性眼病致病基因突变分析研究或患者基因诊断过程中应重视临床表型的准确评估，因为其在很大程度上关系到检测方法的选择和致病基因突变的最后判定。
参考文献：略