作者： 黄燕颖，李秋实，李召东，孙爱华，胡胜平
第一作者及单位： 黄燕颖，杭州市红十字会医院病理科
通信作者及单位： 孙爱华，杭州医学院；胡胜平，杭州市红十字会医院骨科
Rapid diagnosis of Mycobacterium marinum infection using targeted nanopore sequencing: a case report
Huang YY，Li QS， Li ZD，Sun AH，Hu SP.
Front Cell Infect Microbiol，2023，13：1238872.
doi: 10.3389/fcimb.2023.1238872.
PMID: 37965260
研究背景
海分枝杆菌是一种生长缓慢的非结核分枝杆菌（NTM），在全球范围内主要引起呼吸道外的感染。培养法是诊断NTM感染的金标准，然而这种方法耗时而且对于难培养的微生物阳性率很低。牛津的纳米孔测序是第三代测序的前沿技术，能直接对DNA或RNA进行测序，不依赖培养而且能快速检测到微生物。它的优势在于费用低、周期短、读数长和体积小。纳米孔测序在评估药物耐药、临床微生物鉴定和监测感染性疾病方面发挥了重要作用。利用纳米孔测序技术对结核分枝杆菌(MTB)进行研究已经有相关报道，但对海分枝杆菌等NTM的研究报道很少。在这篇文章中，我们报告纳米孔测序诊断海分枝杆菌一例。
个人案例
一位67岁的男性因左手慢性疼痛入院，该病史已使其活动能力和灵活性降低了四个多月。最初是因为左手食指被螃蟹咬了，未进行局部消毒。这导致了感染扩散，左手掌和手腕严重肿胀。B超检查显示左小臂、左腕和左食指屈肌腱鞘有感染性病变。左手腕CT扫描显示拇指肌腱和腕屈肌周围有积液，初步怀疑为腱鞘炎。切除腕部病变被黄色脓性分泌物覆盖。局灶病灶组织送病理检查，病理检查示慢性肉芽肿性炎伴小灶坏死。常规实验室检测MTB和NTM DNA呈阴性。培养42天后未见分枝杆菌生长。对病理切片进行Ziehl-Neelsen染色抗酸杆菌阳性。并且抗酸杆菌荧光染色呈强阳性。因此，有必要进一步区分NTM和MTB。传统上，海分枝杆菌是基于培养的方法来诊断的，然而耗时的是从临床标本中分离出细菌并确定其种属。因此，在临床检测中，显微镜和培养的结果往往是阴性的。PCR和血清学检测是快速且不依赖于培养的技术；然而，这两种方法都需要事先了解病原微生物的类型。此外，这些方法侧重于单个病原体而不是整个种群。幸运的是，牛津纳米孔技术公司(ONT)在纳米孔测序方面的技术进步有可能解决这些挑战。
纳米孔测序流程包括以下：样本收集、DNA提取和扩增、文库制备和纳米孔测序和病原微生物鉴定。在病原微生物鉴定过程中，首先要对原始测序reads进行质量过滤，然后通过EPI2ME平台使用What 's In My Pot (WIMP)软件对测序reads进行细菌分类分析。对< 200bp的读数进行过滤。通过与人类参考基因组比对，去除人类DNA读数。最后，将剩余的reads与NCBI微生物基因组数据库进行比对。病原体在物种水平上分类基于百分比覆盖率。一般来说，根据比对reads排序且相对丰度评分> 0.5%的前10名微生物被归类为病原体，并进行进一步评估。如果reads数占微生物reads数≥1%，且WIMP比对评分≥20，则报告潜在病原体。
结果
此次共获得19,872条reads，其中好的reads有16,918条；所有reads的平均长度为2686 bp(范围为200 ~ 3554 bp)。参考海分枝杆菌菌种(accession:GCA_000723425.2)进行鉴定。有效reads的阳性阈值设置为覆盖率≥85%，识别度≥90%。最后，纳米孔测序检测分泌物样品中为 M. marinum 。reads数为4176条，相对丰度为92.37%。患者接受乙胺丁醇(750 mg/d，口服)、利福平(450 mg/d，口服)和异烟肼(300 mg/d，口服)联合治疗。最后患者的症状完全缓解，在6个月的随访期间没有复发。