“上火”是中医学的一种俗称，其基本病机为阴阳失调，阳胜则热。中医学认为“上火”是在机体受到“邪气”侵袭后，引起机体出现一系列以“热证”为表现的症状。咽喉肿痛、目赤干涩、牙龈发炎、口腔溃疡、小便短赤、大便秘结等为“上火”的典型症状[1]。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪 A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，其味甘，性温，归肺、脾经。黄芪作为一种大宗药材和人们经常以各种方式食用的保健品，具有广泛的应用前景和药理活性[2-3]，但长期过量食用黄芪产生的不良反应少被讨论。由于黄芪性温热，过量进补黄芪可能会导致“上火”症状，且黄芪常用来构建“上火”或实热动物模型[4]。由于“上火”缺乏客观量化的诊断指标，因此应用现代技术揭示“上火”的生物学标志及导致“上火”的物质基础具有重要意义[5]。本研究在中医对“上火”认识的基础上，运用现代生物学技术，开展对过量食用黄芪引发“上火”的机制研究，拟为黄芪保健品的开发提供参考依据。
中药中化学成分复杂，同类的不同成分之间在体内也可能存在相互转化的现象，因此通过成分“敲除”的方法来进行功效的验证难以达到理想的效果。基于此，本研究以黄芪为例，进行了某个“部位”即某类成分的“扣除”，目的是排除“成分敲除”时结构相近的成分在体内转化造成的影响，通过“部位扣除”并结合单个部位给药进行黄芪温热效应引起“上火”的物质基础验证。黄芪主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类等成分[6]。本研究首先对黄芪水煎液进行了部位分离，运用醇沉法分离多糖。由于黄酮类成分含量相对较低，且黄酮部位和皂苷部位极性非常相近，加大了分离的难度[7]。
本研究根据文献报道的树脂分离技术[8-9]，比较了2种方法对黄芪水煎液中黄酮类和皂苷类成分的富集和分离程度，建立了1种快速有效的部位分离方法，并且采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）对所分离的2个部位中化学成分进行鉴别。最后将分离所得各个部位ig给药，从大鼠的一般状态、炎症、甲状腺和肾上腺功能、能量代谢和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路等方面进行指标检测。
1、提取物的主要成分是什么？
经计算得总多糖质量浓度为7.371 0 μg/mL，质量分数为51%；总皂苷质量浓度为4.083 6 μg/mL，质量分数为83%；总黄酮质量浓度为3.985 2 μg/mL，质量分数为81%。
黄酮类成分鉴别
通过XCalibur软件对黄酮部位进行分析鉴别，结果见表1（F1～F21）。通过与对照品 t R及二级碎片对比，成分F4～F6分别被鉴定为芒柄花苷、芒柄花素和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
皂苷类成分鉴别
通过XCalibur软件对皂苷部位进行分析鉴别，结果见表1（S1～S6）。通过与对照品 t R及二级碎片比较，成分S3被鉴定为黄芪甲苷。根据文献报道[17-20]，S1～S6分别被鉴定为黄芪甲苷I、黄芪甲苷II、黄芪甲苷、黄芪甲苷Ⅶ、大豆皂苷I和环黄芪醇。
2 黄芪各给药组对大鼠一般状态的影响
对大鼠体质量的影响
如表2所示，在给药过程中，各组大鼠体质量均逐渐升高，而与对照组相比，各组大鼠体质量无显著性差异。说明各给药组对大鼠体质量的增长影响较小。
对大鼠肛温的影响
如表3所示，与对照组相比，给药第14、28天各给药组大鼠肛温均有所升高，其中全成分组大鼠肛温升高有显著性差异（ P ＜0.05、0.01），可以体现黄芪的温热效应，全成分组温热效应最强。分别“扣除”各个部位后，只有缺多糖组在第14天肛温升高有显著差异（ P ＜0.05），而这种显著性在第28天测定时又消失，其余均无显著性差异，说明对于体温的升高，不是某个部位的单独作用，而是黄芪3个部位以及其余成分的综合作用，符合中医理论的整体观念。
给药第14天，与对照组相比，缺皂苷组与缺黄酮组大鼠唾液量显著升高（ P ＜0.01、0.001）；给药第21天，与对照组相比，全成分组、缺多糖组与缺黄酮大鼠唾液量显著降低（ P ＜0.001），黄酮组与缺皂苷组大鼠唾液量显著升高（ P ＜0.05）。给药第28天，与对照组相比，多糖组、皂苷组与缺黄酮组大鼠唾液量显著降低（ P ＜0.001）。全成分组在第21、28天唾液量均减少，可能为“上火”症状的体现。多糖组、皂苷组在第28天唾液量显著降低，而缺多糖组、缺皂苷组唾液量并没有降低，黄酮组唾液量没有显著降低，而缺黄酮组即多糖和皂苷配伍组唾液量显著降低，说明长时间大剂量服用黄芪导致唾液量减少的“上火”症状来源于黄芪组分中的多糖部位和皂苷部位。
对大鼠摄食量、粪便量及粪便含水量的影响
如表4所示，给药第14天，与对照组相比，多糖组大鼠摄食量显著减少（ P ＜0.05），黄酮组大鼠摄食量显著升高（ P ＜0.001）；给药第21天，与对照组相比，缺皂苷组和缺黄酮组大鼠摄食量显著降低（ P ＜0.01、0.001）；给药第28天，与对照组相比，缺黄酮组大鼠摄食量显著减少（ P ＜0.001）。
与对照组相比，除全成分组大鼠粪便量有所减少外，其余组别大鼠粪便量均升高，其中黄酮组具有统计学意义（ P ＜0.01）。对于粪便含水量而言，与对照组相比，全成分组与多糖组大鼠粪便含水量显著降低（ P ＜0.05、0.01），缺皂苷组大鼠粪便含水量显著升高（ P ＜0.001）。
联合摄食量和粪便量可知，黄酮组粪便量显著增加的原因可能为摄食量的增加，而全成分组以及多糖组粪便含水量显著降低则可能为“上火”症状的体现。结合全成分组、多糖组以及缺多糖组的粪便含水量，说明对于粪便量干燥的“上火症状”可能主要源于多糖类组分。
3 黄芪各给药组对大鼠血清炎症因子的影响
如图5所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组大鼠血清中TNF-α水平显著升高（ P ＜0.05、0.001），缺皂苷组大鼠血清中TNF-α水平没有升高，而缺多糖组依然显著性升高（ P ＜0.01），说明黄芪全成分升高TNF-α的作用可能来自于皂苷部位、多糖部位，且皂苷部位的影响可能较大。此外，与对照组相比，全成分组血清中IL-1β水平显著升高（ P ＜0.05），多糖组IL-6表达水平显著升高（ P ＜0.01）。表明过量食用黄芪时，其多糖和皂苷可能通过升高促炎因子水平诱发炎症反应，导致“上火”症状。
4 黄芪各给药组对大鼠血清甲状腺功能的影响
如图6所示，与对照组相比，多糖组、皂苷组和黄酮组大鼠血清中T3水平显著降低（ P ＜0.05），缺黄酮组大鼠T4水平显著升高（ P ＜0.05），各组大鼠TRH水平无显著差异，黄酮组大鼠TSH水平显著降低（ P ＜0.05）。说明黄芪的温热效应可能不是通过促进甲状腺功能产生。
5 黄芪各给药组对大鼠肾上腺功能的影响
如图7所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组、缺多糖组和缺黄酮组大鼠血清中17-OHCS水平均显著升高（ P ＜0.05、0.01），而黄酮组没有升高，说明黄芪温热效应可能还来自于多糖、皂苷部位对肾上腺功能的促进。
6 黄芪各给药组对大鼠能量代谢的影响
如图8所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组、缺皂苷组、缺黄酮组大鼠肝组织中Na+, K+-ATP酶活力都有升高的趋势，其中全成分组和缺黄酮组有显著性差异（ P ＜0.05）。与对照组相比，全成分组、缺皂苷组、缺黄酮组Ca2+, Mg2+-ATP酶活力都有升高的趋势，其中全成分组和缺皂苷组有显著性差异（ P ＜0.05、0.001）。Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活力增加，耗能和产热增加，说明全成分组可以增加机体产热，而多糖与黄酮或皂苷部位配伍之后对产热影响较大。
*酮丙**酸可氧化脱羧生成乙酰辅酶A，然后进入三羧酸循环，最终完全被氧化成CO2、H2O和大量的ATP。与对照组相比，多糖组、皂苷组以及缺皂苷组、缺黄酮组*酮丙**酸含量有增加的趋势，但无显著性差异。与对照组相比，全成分组、多糖组、缺多糖组和缺黄酮组SDH活力有所升高，其中全成分组和多糖组有显著差异（ P ＜0.05、0.01），而黄酮组SDH活力显著降低（ P ＜0.05）。说明全成分组、多糖组可促进三羧酸循环加速，促进ATP的生成增加。与对照组相比，皂苷组肝组织LDH活力显著降低（ P ＜0.05），其余各组无显著性差异，说明皂苷组可以降低机体无氧代谢的水平。与对照组相比，全成分组、多糖组、黄酮组、缺皂苷组以及缺黄酮组肝糖原含量都有上升的趋势，其中缺皂苷组与缺黄酮组有显著差异（ P ＜0.01、0.001），说明含有多糖的配伍组会增加机体的储能。
7 黄芪各给药组对AMPK介导的PGC-1α/NFR1通路的影响
如图9所示，与对照组相比，全成分组、多糖组均可上调大鼠肝组织 AMPK mRNA表达水平，其中全成分组有显著性差异（ P ＜0.05）；全成分组、多糖组均可显著性增加 PGC-1α 、 NRF1 和 TFAM mRNA表达水平（ P ＜0.05、0.01）；此外，缺多糖组可显著上调 NRF1 mRNA表达水平（ P ＜0.05），缺皂苷组和缺黄酮组可显著上调 TFAM mRNA表达水平（ P ＜0.01、0.001）。
如图10所示，与对照组相比，各组均可显著上调p-AMPK、PGC-1α和TFAM蛋白表达水平（ P ＜0.05、0.01、0.001），各组均上调NRF1蛋白表达水平，其中全成分组、多糖组和缺多糖组有显著性差异（ P ＜0.05、0.01）。因此，黄芪全成分组可以促进AMPK功能活化，并作用于下游PGC-1α、NRF1等因子，从图中可以看出多糖部位对 AMPK 、 PGC-1α 、NRF1和TFAM的mRNA表达水平影响较大，同时对p-AMPK、PGC-1α、NRF1和TFAM的蛋白表达水平的影响也较大。
讨论
黄芪温热效应引起“上火”的物质基础及机制分析
《黄帝内经》有载：“气有余便是火”，而黄芪作为“补气圣药”，长期过量食用可能引发“上火”反应。体温升高、大便干燥为“上火”的症候。对大鼠的肛温研究结果表明，黄芪全成分组最为显著，是黄芪温热药性的体现，而体温升高可能是多方面综合作用的体现，如对肾上腺功能的作用，对炎症因子的作用，对能量代谢的作用等，因此虽然各个部位对各个指标的作用有差异，但最终体温的升高来源于几个部位的综合作用，而非单个部位的作用，因此全成分组体温升高最为显著。结合第28天，从各个部位对体温升高的贡献来看，多糖部位贡献最大。
全成分组、多糖组粪便含水量降低显著，体现出大便干燥的症状，而缺多糖组粪便含水量有所升高，因此多糖部位对粪便干燥的“上火”症状影响较大，结合缺皂苷组粪便含水量显著增高，而缺黄酮组粪便含水量降低，表明皂苷对粪便干燥的“上火”症状也有一定的贡献。《尚书》有言：“火曰炎上”，“上火”常出现的症状集中在头面部，如口舌生疮、嗓子干痛、流鼻血等，因此对大鼠的唾液量进行研究，研究结果表明，全成分组、皂苷组、多糖组或含有多糖与皂苷的配伍组大鼠唾液量显著降低，因此多糖部位和皂苷部位对唾液量减少的影响较大，其中多糖部位的影响大于皂苷部位。
Huang等[21]认为过量食用龙眼导致的“上火”与炎症相关，因此本研究对炎症因子进行了测定。从实验结果可知，黄芪多糖可显著上调TNF-α与IL-6水平，黄芪皂苷可显著上调TNF-α水平，黄酮组的IL-6和IL-1β水平显著降低。由此推测，长期超剂量服用黄芪引发的“上火”可能是由黄芪多糖部位或皂苷部位导致。黄酮部位则体现一定的抗炎活性，也有研究表明黄酮类成分可以通过下调IL-6、IL-1β的水平来改善炎症反应[22-23]。说明黄芪的“上火”反应是各部位成分综合的效应，因此在机体本身有一定“阴虚阳亢”症状时，“上火”反应会更加明显。
研究表明，患有“热证”大鼠能量代谢紊乱，尤其是与甲状腺功能和钠泵的活性变化相关[24]，因此对甲状腺功能进行了测定。在对大鼠甲状腺功能的研究中发现，除缺黄酮组的T4含量有一定的升高外，其余组别均无显著性升高，这说明黄芪导致“上火”可能不通过甲状腺功能轴实现调节。
而相关研究[25-26]认为“上火”与交感肾上腺系统相关，17-OHCS可以反映交感神经-肾上腺系统功能，肾上腺功能的亢进与其分泌呈正相关，因此本研究对血清中的17-OHCS进行了测定，结果表明，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组等17-OHCS含量显著增加，表明以上部位对肾上腺功能有一定的促进作用。能量代谢包括能量的产生与消耗，在这个过程中ATP能直接反映生物体能量代谢水平的高低，是能量的“通用货币”，ATP酶主要存在于细胞膜与细胞器膜上，其功能是将ATP水解并释放出能量，因此对Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶的活力进行了测定。
在黄芪及各组分对Na+, K+-ATP酶活力的影响中发现全成分组、缺黄酮组增强显著，全成分组、缺皂苷组Ca2+, Mg2+-ATP酶活力增强显著，可以推测全成分组与含有多糖的配伍组可以促进大鼠ATP的分解和产热。SDH是反映线粒体功能的标志酶，其活性的上调代表三羧酸循环的加速与ATP的增加[27]，LDH广泛分布在组织中，其活力代表了肝脏的厌氧代谢水平，全成分组、多糖组对SDH具有促进作用，皂苷组对LDH有抑制作用，且多糖部位对于黄芪促进ATP增加作用的贡献最大。肝糖原是由大量葡萄糖分子聚合而成的多糖，以糖原的形式储存在肝脏中，它可以在需要的时候分解成葡萄糖，同时产生能量，多糖组、缺皂苷组和缺黄酮组的肝糖原含量较高，推测因有多糖的存在导致糖原储存较多。
有专家认为，“上火”表现出的皮肤黏膜的红肿热痛、溃疡等症状，与能量代谢密切相关[28-29]。AMPK能够灵敏地感应细胞内二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）/ATP和单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）/ATP的比值变化，被视为“能量传感器”和“能量代谢的总开关”。PGC-1α主要存在于含有线粒体的组织中，它可以在AMPK的调节下辅助激活NFR1与TFAM，促进线粒体的合成[30]。
赵婷等[31]通过建立实热“上火”动物模型对AMPK能量代谢方面进行研究，表明红参引发的“上火”与AMPK等上调相关。张喜召等[4]通过建立“上火”模型研究表明对“上火”动物模型中AMPK-PGC-1α信号通路受到抑制。本研究结果表明，黄芪及各部位对AMPK介导的通路中的关键蛋白AMPK、PGC-1α、NFR1、TFAM有上调作用，各组分均可促进能量代谢，增强能量储备（图11）。因此黄芪引发的“上火”反应机制可能与AMPK介导AMPK-PGC-1α通路相关。比较各组的作用大小发现，多糖组作用较强，与全成分组相当或者高于全成分组。
综上所述，通过“部位扣除”结合单个部位给 药，对黄芪引起的“上火”反应从炎症反应、肾上腺功能、ATP酶活力、SDH活力以及AMPK介导的AMPK-PGC-1α通路等方面进行探讨，发现黄芪的3类成分中多糖类成分可能对“上火”的影响较大，在黄芪相关保健品开发时，可以采用一定的方法控制黄芪多糖的含量，以达到减少“上火”反应的目的。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：曹丽珑，裴 科，刘 瑞，宁 燕，赵婷婷，于子涵，吴陈成，邵翔宇，张朔生，王颖莉，胡美变，蔡 皓．基于“部位扣除”的黄芪温热效应导致“上火”反应的物质基础及机制研究 [J]. 中草药, 2022, 53(14): 4350-4364 .