[研究]重离子肿瘤放射生物学的研究进展/ 中华放射肿瘤学杂志
2016-09-14 快速關注► 重离子质子
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本文作者： 乐紫妤（2014级复旦大学硕士研究生），刘勇；来源：中华放射肿瘤学杂志, 24 (5): 600-604, 2015
重离子，简言之，即比粒子（氦4）重的离子（如碳12、氖22、钙45等），因加速后拥有物理剂量分布和生物学方面的双重优势而备受肿瘤放疗界关注。限于实验设施、基础及临床资料影响，目前对重离子的放射生物学效应，包括肿瘤细胞*伤杀**效应、对肿瘤血管生成和转移的影响及诱发第二肿瘤等尚缺乏全面认识。笔者就重离子（主要是碳离子）的基本生物特征以及相关生物学研究进展做一综述。
一、重离子放射生物学特征
1.RBE值高：重离子射线属于高LET射线，其LET值随射程深入而升高，同时RBE在一定范围内也相应升高，形成Bragg峰内高而峰外低的分布，有利于提高肿瘤局部控制的同时保护周围正常组织。以碳离子为例，Bragg峰区域内的RBE值一般在3左右，坪区的RBE值约为1.0~1.5[1]。但这一数值并不通用，RBE为相对值，不仅与射线LET值相关，与粒子种类、剂量分割、细胞类型及生物研究指标等均密切相关[2]。以剂量分割为例，在其他条件不变的情况下，增加重离子放疗的单次剂量可降低RBE值，且正常组织RBE降低较肿瘤组织更明显，因而低分割放疗能取得更好的治疗比[3]。
2.氧增强比低：根据氧固定假说[4]：低LET射线的生物效应以电离辐射的间接作用为主，依靠产生的自由基造成靶分子损伤（通常是DNA），照射时需要氧与自由基起反应将放射损伤固定下来；而高LET辐射主要通过直接作用的方式作用于生物大分子，氧浓度依赖小，氧增强比小，因此能一定程度上减少乏氧带来的放射抵抗。Nakano等[5]的子宫颈癌临床试验证实了这一点。根据氧增强比与LET的反比关系和重离子Bragg峰内高LET、峰外低LET的特点，Bassler等[6]提出LET规划：将粒子线高LET部分限制在肿瘤缺氧区，低LET部分应用于含氧量正常区域，以达到对乏氧细胞最大程度杀灭的同时保护周围正常组织。
3.诱导复杂DNA损伤：辐射致DNA损伤有单一位点损伤和多位点损伤即集簇性损伤，后者又分为DSB-集簇性损伤和非DSB-氧化性集簇性损伤[7]。与光子相比，高LET重离子辐射能产生更多更复杂的集簇性DNA损伤，且以DSB-集簇性损伤为主，损伤修复更为困难，更易造成细胞死亡、突变和恶性转化。DSB被认为是电离辐射在染色体上导致的最关键损伤，其修复有NHEJ和HR两种方式，重离子能呈LET依赖性地抑制Ku蛋白依赖的NHEJ主要途径，但HR不受明显影响，因而高LET射线联合HR阻断治疗也许能成为增强肿瘤细胞放射敏感性的新策略[8-9]。
4.*伤杀**效应不受细胞周期影响：1975年Bird和Burkina首次提出高LET射线能呈LET依赖性地降低细胞周期放射敏感性差异。机制至今仍不完全清楚[8]。Wang等[10]认为S期细胞相比非同步细胞和分裂期细胞对低LET射线更为耐受是因为哺乳动物细胞在S期能同时利用NHEJ和HR两种途径修复DSBs，但高LET射线能抑制Ku蛋白依赖的NHEJ途径，并发现Ku蛋白与高LET辐射导致的DSB片段的有效结合在S期较其他时相更少，致使残留DSBs增多，产生放射增敏效应。
二、重离子的生物学研究进展
（一）肿瘤细胞放射抵抗相关因素对重离子放疗的影响
1.低α/β比值：由LQ模型衍生出的α/β比表示引起细胞*伤杀**中DSB和2个单链断裂组合发生概率相等时的剂量。大多数人类肿瘤组织同早反应正常组织一样，α/β比值高,对光子放疗有较强反应性。低α/β比值肿瘤近年来也有被发现，如横纹肌肉瘤、黑色素瘤等，这类肿瘤大多对传统放疗反应较差。高LET重离子辐射导致的DNA损伤以难以修复的复杂DSB为主，能减少肿瘤细胞杀灭中的β成分，削弱低α/β比值肿瘤的放射抵抗，提高LC率[11]。
2.HIF：HIF-1是由受胞内氧调节的HIF-1α和组成性表达的HIF-1β组成的异源二聚体，具有转录活性，缺氧时稳定表达。参与癌细胞放疗后的保护性反应：刺激肿瘤细胞分泌VEGF及其他血管生成因子，保护微脉管系统，促进肿瘤血供和营养供应的恢复；同时增强糖酵解途径，促进糖代谢产物的积累，提高肿瘤的抗氧化能力和放射抵抗性。研究表明光子能增强HIF-1介导的信号通路及其下游靶基因的表达[12-13]；但碳离子并无此效应，在A549细胞小鼠移植瘤模型中碳离子甚至能显著下调HIF-1α蛋白表达[13]，减少HIF-1介导的肿瘤放射抵抗。
3.肿瘤干细胞：肿瘤干细胞被认为是辐射高度抗性的一个细胞群体，其乏氧分数高，DNA修复能力强，部分细胞处于分裂静止期，但受刺激后可再次进入细胞周期，启动DNA合成，导致治疗后的局部复发和转移[14]。低LET射线因主要*伤杀**非干细胞的肿瘤细胞，加上放射后加速再群体化，往往导致放射后肿瘤干细胞富集[11]；Cui等[15]以CD133、CD44和ESA标记结肠腺癌干细胞，发现碳离子在体内、外实验条件下对肿瘤干细胞和非干细胞样肿瘤细胞均有*伤杀**作用，并无放射后肿瘤干细胞富集出现。Oonishi等[16]使用胰腺癌细胞也得出相似的结论。值得注意的是，目前对肿瘤干细胞的识别或检测方法并没有形成标准，通常是通过一些细胞表面标志物[17]，但肿瘤干细胞的一些生物特征在一些非干细胞样肿瘤细胞中也可能见到，CD133、CD44等也可以表达于其他细胞表面，因而建立一个共同认可的标准化肿瘤干细胞鉴定方法或系统对进一步的研究很有必要。
4.p53突变：抑癌基因p53在DNA损伤诱导的细胞凋亡中起关键作用，p53功能缺失的肿瘤细胞，在放疗后因不能启动凋亡程序导致细胞存活增加，产生放射抵抗[3]。研究表明高LET重离子辐射不仅能诱导p53依赖性细胞凋亡，也能诱导不依赖p53的细胞凋亡，因此能削弱p53突变带来的放射抵抗，且这一效应呈LET依赖性[18]，机制尚不完全清楚。Yamakawa等[18]发现Caspase-3和Caspase-9都参与了碳离子和铁离子诱导的凋亡反应，认为高LET重离子辐射下细胞可能可以通过活化p53下游的效应分子激活线粒体通路，活化Caspase-9，进而裂解活化Caspase-3，启动凋亡。而后有研究报道Akt生存信号通路受抑可能也与Caspase-9活化和细胞存活降低相关[19]。
5.Bcl-2过表达：抗凋亡蛋白Bcl-2过表达可见于半数以上的人类肿瘤，随之带来的凋亡抗性使得这些肿瘤往往对传统放疗反应不佳。Hamada等[20-21]曾报道体外高LET重离子照射能以剂量和LET依赖的方式减少Bcl-2过表达的HeLa细胞的放射抵抗，且这一效应可能与重离子增强细胞凋亡反应、延长细胞周期阻滞和提高细胞迟发的增殖性死亡有关。进一步研究发现虽然60Coγ线和碳离子都不改变Bcl-2蛋白水平，但后者较前者能更有效增强Bcl-2在Ser-70位点的磷酸化[22]，使之丧失抗凋亡活性。
6.肿瘤微环境：微脉管系统作为微环境的重要组成部分，与肿瘤生长、侵袭、转移和复发均密切相关，众多研究表明亚致死剂量的光子照射能促进肿瘤血管生成。而对重离子，目前的研究结果并不一致：大多数学者观察到碳离子照射能抑制内皮细胞黏附和迁移，破坏其管状结构形成，同时伴随MMP-2活性抑制、整合素αVβ3下调和VEGF 表达下调[23-25]。Cui等[15]的结肠腺癌细胞体内实验也印证了这一点。但部分学者观察到相反情况，如Ando等[26]发现单次15Gy碳离子照射能诱导肺鳞癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平增高。另外，也有得出无明显影响的结论，如德国GSI的两项以A549细胞为模型的实验，肿瘤细胞VEGF mRNA和蛋白水平以及相应体内实验中肿瘤微血管密度均不受碳离子照射明显影响[13,27]。值得注意的是，Liu等[28]观察到碳离子的血管生成抑制效应可能存在有效剂量， Nojiri等[29]发现碳离子促血管生成的作用可能与癌细胞本身放射反应性相关，因而实验体系（如实验细胞种类、碳离子射线的LET及物理剂量）和实验观察方法的不同可能是形成此种差异性结论的原因之一。
7.肿瘤代谢：肿瘤细胞获取能源以糖酵解途径为主（Warburg效应），其代谢产物——*酮丙**酸、乳酸、还原型谷胱甘肽和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）形成了细胞内氧化还原缓冲网络，能有效清除自由基和活性氧物质，减少自由基介导的DNA损伤[12]。但重离子的细胞损伤效应以辐射直接作用为主，并不受其明显影响。另外，许多研究表明还原型谷胱甘肽水平与细胞氧化性DNA损伤性质和损伤修复能力有关[30]，内源性还原型谷胱甘肽水平高的肿瘤细胞对X线所致DNA损伤具有更高的修复能力，但对高LET重离子辐射后的DNA损伤修复影响不大[31]。还原型谷胱甘肽耗竭治疗与光子治疗结合具有放射增敏的效应已被多种研究证实，Hanot等[32]发现内源性还原型谷胱甘肽耗竭与重离子治疗结合不仅能达到放射增敏，还能降低基因组不稳定性，减少放疗后肿瘤细胞适应和逃逸现象，提高局LC率。
（二）重离子放疗影响肿瘤侵袭及远处转移
迁移和侵袭是肿瘤细胞播散转移的重要步骤，辐射对肿瘤迁移能力和侵袭性的影响与放疗后的转移复发风险密切相关。许多体内外研究表明碳离子能呈剂量依赖性地抑制肿瘤细胞侵袭和转移[33-38]，相关机制可能涉及整合素表达下调[34]、基质金属蛋白酶活性降低[35]、VEGF表达下调致FAK信号通路活化受抑[25]等，但尚有争议，如Ogata等[36-37]观察到肿瘤细胞迁移能力降低与PI3K/Akt信号通路受抑相关，而在Stahler等[38]的研究中体外碳离子照射在降低胶质瘤细胞迁移能力的同时并不明显影响EGFR及其下游Akt和ERK1/2的表达和磷酸化水平。另外，近年有资料显示碳离子能增强细胞侵袭，Fujita等[39-40]发现碳离子照射能抑制或削弱胰腺癌MIAPaPa-2、BxPC-3和AsPC-1细胞的迁移和侵袭，但能增强PANC-1细胞侵袭；而后以2Gy碳离子对其他30种不同肿瘤细胞系进行筛查，发现人胶质母细胞瘤SF126细胞也存在照射后侵袭性增强反应；进一步研究发现该侵袭性增加效应与细胞在基因毒性应激下产生NO激活PI3k-Akt通路和RhoA通路相关；而对碳离子如何产生这种细胞特异性效应，作者认为细胞系遗传背景的异质性可能是根本原因。类似的，Murata等[41]观察到碳离子可通过增强Rho信号通路增强A549细胞运动，与上述不同的是，Murata等[41]使用的是细胞划痕实验，观察的仅是细胞在水平方向的运动能力，并无胞外基质的阻碍，与体内状态尚有差距。另外，Karger等[42]发现剂量分割也可能影响碳离子治疗下的肿瘤转移率，更高的分割治疗似乎能促进肿瘤转移。
（三）重离子对细胞基因表达的影响
研究表明，重离子对细胞基因表达的影响，无论是从差异表达基因的数目还是差异表达的程度上来说都较光子更为显著。这些转录发生明显改变的基因大多与细胞周期调控、肿瘤侵袭、血管生成及细胞组织结构相关[29,36,43-44]。Suetens等[43]通过对前列腺癌细胞的全基因组微阵列分析观察到2Gy碳离子照射后8h细胞运动相关基因的表达明显下调，且这一效应似乎呈剂量依赖性；其中FN1基因低表达与前列腺癌患者无转移存活时间延长明显相关，提示FN1有可能成为前列腺癌预后生物指标。Imadome等[44]观察到30Gy碳离子照射后6、24h与细胞应激和细胞通讯相关的基因表达明显上调，并认为可能与碳离子作用后细胞内大量累积的未修复损伤相关。另外，碳离子还能上调一些免疫相关基因表达，如编码白介素和趋化因子的基因，这也许能解释照射后肿瘤细胞免疫原性增强的现象。目前对碳离子照射后发生表达上调和下调基因的认识仍存在一些分歧，在一些实验中观察到上调的基因可能在另一实验中观察到相反结果，这可能与不同研究中所使用的肿瘤细胞类型不同，观察时间点不同以及射线LET、剂量等方面存在的差异相关。
（四）重离子诱发恶性肿瘤效应
由于复杂DNA损伤被认为更具诱变性，因而对青年（尤其是儿童）以及生存期较长的肿瘤患者，重离子治疗的诱变致癌风险可能增高。目前关于重离子治疗后发生第二肿瘤风险的资料正在逐步积累：Imaoka等[45]通过SD大鼠乳腺癌诱导模型发现婴幼儿期大鼠较成年早期者对重离子辐射诱发乳腺癌的敏感性更低；德国海德堡离子治疗中心正开展儿童和青年肿瘤患者粒子治疗临床试验[46]；在Uhl等[47]的碳离子临床试验中，79例颅底软骨肉瘤患者在近十年随访期内无一发生第二肿瘤。而后的研究可能还需要进一步扩大患者数量、延长观察时间，另外有必要对重离子、质子和光子放疗后发生第二肿瘤的风险进行比较，以利于患者治疗方式的最优化选择。
三、临床应用及结语
随着重离子照射技术和设备的推广及发展，相关基础及临床研究成果也越来越多。自日本NIRS（1994年）以及德国GSI（1997年）开始，世界各地已陆续出现了很多重离子治疗设施，越来越多实验证实重离子对一些实体肿瘤能通过更少的治疗次数、更短的治疗时间取得更优于传统治疗的疗效。Uhl等[47]报道了碳离子治疗颅底软骨肉瘤的首个长期临床试验数据，患者放疗后的3、5、10年LC率分别为95.9%、88.0%、88.0%，OS率分别为96.1%、96.1%、78.9%，不良反应均在可承受范围，随访期内无一发生第二肿瘤，现实验已进入第三期阶段。
但另一方面，重离子治疗作为一种新技术手段，和其他治疗手段一样，也存在一定局限性，例如其在食管癌等空腔脏器肿瘤治疗中由于穿孔等高风险使得应用受限，在儿童脑肿瘤治疗中因正常组织损伤风险及第二肿瘤风险不明亦比较慎重。Nakano等[5]发现其对比光子治疗对乏氧的宫颈癌具有良好的局控效果，但对富氧的肿瘤，光子及重离子治疗的获益并无差别。另外部分患者治疗后即使获得极佳LC，但后期仍发生远处转移。可见重离子放疗的有效应用还需进一步深入探讨。
综上所述，重离子射线具有明显的生物学优势，但其生物效应依然受生物本身的影响。重离子在治疗对传统放疗抗拒的肿瘤具有一定优势，但其实际应用仍需深入探讨，包括不同治疗设施之间的横向比较等。目前对重离子生物效应的认识依然有限，其应用价值的扩大需要进一步从生物角度挖掘。因此，深入全面阐明其放射生物学效应相关机制，综合个体易感性差异及治疗成本等多方面因素，对更为有效地发挥重离子放疗优势、实现重离子个体化治疗具有重要参考价值，也是进一步推广重离子放疗的关键。
参考文献：略
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