#1
专家意见： How many times were the experiments repeated? n=?
译文： 实验重复了多少次？样本量是多少？
编辑解读：
重复原则是实验设计过程中, 除了随机和对照之外，必须遵循的又一个重要原则。由于个体差异等影响因素的存在，同一种处理对不同的受试对象所产生的效果不尽相同,其具体指标的取值必然有高低之分,只有在大量重复实验的条件下,该处理的真实效应才会比较确定地显露出来，因此，在实验研究中,必须坚持重复的原则。
重复通常有三层含义,分别是重复实验、重复测量和重复取样。重复实验是指在相同的实验条件下，进行两次或两次以上独立的实验，目的是为了降低以个体差异为主的各种实验误差。重复测量是指受试对象接受某种处理后,在不同时间点或对称的不同部位上被重复检测某定量指标的数值大小，目的是看定量指标随时间推移的动态变化趋势或部位改变条件下定量指标的分布情况。重复取样就是在同一个时间点从同一受试对象身上或同一个样品中取得多个标本,目的是看各标本中某定量检测指标值的分布是否均匀或检测方法是否具有重现性。
实验设计中所讲的重复原则指的是重复实验，即在相同的实验条件下的独立重复实验的次数应足够多。这里的“独立”是指要用不同的个体或样品做实验,而不是在同一个体或样品上做多次实验。
重复原则的作用在于：要想比较正确地反映随机实验结果出现的一般规律,必须进行大量的独立重复实验。因此,重复的作用就是确保能真实地反映随机变量的统计规律性。它可以排除随机误差的干扰和影响,使实验因素的效应真实地显露出来。
实验结果不能重复，究其原因可以大致归为三大类：主观原因、客观原因、技术原因。
主观原因 就是我们说的“学术造假”——利用各种手段“优化”数据，甚至篡改捏造实验数据结果。这是绝对要遭到谴责和杜绝的。
但很多时候，由于作者在设计实验的阶段就存在缺陷，甚至是论文写作存在瑕疵都会“无心之失”导致其结果无法被他人重复。这就是所谓的客观和技术原因。
客观原因 主要指不受科研人员控制的一些原因或实验的一些随机性。例如细胞实验中各实验室按照各自的习惯培养，养着养着就不一样了，还有就是试剂的问题等。
技术原因 主要指科研人员的操作能力，分析处理数据的能力，甚至是论文写作技巧等问题。有些实验操作记录并没有写的非常详细，中间可能漏掉了一两个看似无足轻重的步骤，后面的人在重复的时候按照记录很有可能就得到一个很不一样的结果。
在实验设计实施中，可以考虑从如下方面着手，进行重复实验：
1. 合适的样本量
重复原则中最重要的具体实施，就是样本含量的确定，简单来说就是你的结果能够在不同样本中重现。样本量太少，难以排除偶然的误差，出现了非真实的阴性结果也并不能代表总体。
然而，样本量也不是越大就越好。样本量太大会导致人力、物力和时间上的浪费，并且由于可能过分求数量，导致投入不足，质量控制下降也会对研究结果造成不良影响
样本含量的估计需要借助于特定的公式，根据研究目的、资料性质、实验设计类型及分析方法的不同来设计确定。根据前人经验，动物实验研究中，如果是小动物实验（如小鼠来源方便，花费不太大)，各组动物数不少于10只为宜。若是较大动物实验，各组动物数不少于5只为宜。
2. 必要的独立重复次数
仅仅样本量有重复是不够的，也就是说一个实验动物组选取多只动物进行实验并不能算完整的实验重复原则，而应该在实验条件和动物福利允许的情况下，在相同条件下进行3次或以上的独立实验。
3. 样本自身的可重复性
确定样本量之后，也要考虑到实验结果在各个样品中的再现性，即样本自身的可重复性，因此在选取动物时应注意动物的种属、性别以及饲养环境等对结果的影响。
提升实验可重复性的技巧：
1.记录
人的记忆力是有限的，在做实验的时候，不可能记住做过的每一步，所以做实验一定要做好实验记录。记录一要及时，二要详细，三要整洁。
例如：配好的试剂做好标签也是一种记录，标签一定要详细：包括试剂名称、配置日期、配置者及其它必要信息。在配试剂的时候，为了防止忘记贴标签的情况，应该先贴标签，再加试剂。对于某些重要信息，可以记录到电子文档便于后期检索。
另外，实验记录一定要详细，室温不是一个好的表述，不同季节室温是不一样的，一定要注明具体是多少度。实验记录时要将你能想到的变量都记录上，这是为了以后重复实验能够保证条件完全一致，同时也是为了写论文时，迅速回忆起当时实验的条件
2.核查
很多时候，实验失败的原因是没有仔细核查，每一个小错误都可能导致实验失败，所以一定要养成仔细核查的习惯。具体来说，在加试剂的时候，一定要仔细核查标签(包括试剂名称、配置日期)，是否有沉淀，颜色是否改变等;使用仪器的时候，要核查设置，例如温度、转速、时间设置等。电泳的时候，要核查是否有气泡冒出。使用实验动物的时候，要核查表型等。
3.分装
为了保证不同批次实验使用的试剂都是一致，一定要将试剂分装保存，尤其是不稳定的药品，蛋白质，核酸等等。这样每次实验只使用一管。另外，分装药品也方便实现不同人公用试剂。将公用药品分装成小份分给每个人，分给自己的就不要让别人用，分给别人的自己就不要用。
分装有很多好处。第一，保险：可以防止因为污染、变质等原因损失全部试剂或者样品；第二，容易混匀：分装后，每一管溶液量小，解冻时容易全部溶解；第三，延长保质期：很多试剂都要低温保存，如果不分装，每次使用的时候都全部受热一次，变质就会很快。
4.混匀
实验对很多试剂的用量都有明确要求。要保证实验的成功和可重复性，必须保证试剂用量一致。用量等于体积乘以浓度，如果溶液不混匀的话，浓度就会不同，即使加样体积一样，实际的量也可能不一样。所以，一定要保证试剂是充分混匀。结冰的试剂，必须完全溶解才可以使用。容易沉淀的试剂，使用之前必须充分vortex后再快速离心一下才能使用。
5.备份
为了防止实验记录丢失的情况，可以把实验记录扫描为PDF文档以备份。同时，对于重要的研究数据，最好整理成电子文档例如excel或word文档，并且养成对自己的电脑文件定期备份的习惯。此外，质粒、转化后的细菌也需要备份。最好备份两份以降低丢失的概率。
6.仔细设计实验对照
对照能够让你在实验失败的时候迅速找出实验失败的原因。对照可以分为阳性对照（postive control）和阴性对照(negative control)。
好的 control的作用就是提高实验摸索的效率，让我们每一次实验不管成功还是失败都是带来信息量的 ，而不是简单的失败或者成功结果。positive control是指肯定会得到预期结果的实验对照组，比如之前自己成功过的实验组、实验组他人验证过成功的实验组或者在各方面考虑都不会出现大意外的实验组。positive control的作用主要有二，一是检查人与人之间的差异，二是检查实验环境/条件的差异。如果实验室其他人对于某个实验基本都能成功，我把这个实验接过来，用在我的实验对象上的同时也用在他的实验对象上，那么都成功了则说明这个实验技术很robust；如果他的对象成功了我的失败了，则说明有可能这个方法对于我的对象不work；如果都失败了则说明有可能是我的操作有问题。那有同学问了，如果他的对象失败了而我的却看起来成功了呢？这就是negative control的用处了。negative control的作用是评估假阳性的可能性与影响大小的。接上面的例子，如果他的对象失败了，我的对象成功了，但是我的negative control也成功了，那就说明我的对象看似成功，实则很可能是假阳性；如果我的negative control失败了，则说明很有可能是我的实验也是成功的， 只是他的实验对象我不熟悉，掌握不好，所以失败了，但是并不影响我得到阳性的结果。
7.使用同一台实验仪器
以PCR为例。不同厂家生产的PCR仪效果可能不一样，在研究蛋白质热稳定性时，需要用PCR仪给蛋白质加热，然后研究蛋白性质的变化。如果实验室有两台PCR仪，尽管两台PCR仪设置的温度和时间是一样的，但加热效果也可能会并不一样。
8.复杂实验设置关键检查点
生物化学实验内操作对象都是肉眼不可见的，对于稍微复杂一点的实验都需要设置检查点。比如在大肠杆菌内表达一个蛋白质。大概步骤是：获得DN*片A**段，将DN*片A**段插入表达载体，将重组载体转化进入宿主细胞。那么检查点至少有三个。第一个，确定是否获得了DNA 片段；第二个，确定DN*片A**段是否插入到表达载体；第三个，确定重组载体是否转化进入了宿主。在平常的实验中，除非对某个检查点非常有信心，可以不用进行检查，否则万不可着急。这种赶进度经常会让实验更慢。
9.顺序
有时候需要给很多试管加不同的试剂。这么多试管和试剂，一不小心，就会忘记哪一管或者哪一样试剂加了没有。即使是只有两三个试管，有时候加了一个样品，忽然就忘记是加了哪一管了。如果是按字母或者数字顺序加样的话，在这种情况下，就会清楚是加了哪一管。
#2
专家意见： For the cell viability assay, the description appears to imply that a single passage of cells was used but the figure legend for Figure 4 states that "Three independent repeated tests were performed". The authors are encouraged to clarify whether this experiment was conducted using one 96- well plate from a single passage of cells, which is the equivalent of doing an experiment on a single mouse, or whether 3 different passages of cells were used to seed separate 96-well plates.
译文： 关于细胞存活率测定，描述似乎暗示使用的是单个传代细胞，但图 4 的图例却说 "进行了三次独立的重复测试"。我们鼓励作者澄清这项实验是使用一个96孔板中的一代细胞进行的，这相当于在一只小鼠身上做实验，还是使用了3个不同代细胞分别接种于不同的96孔板中。
编辑解读： 在细胞培养过程中，除了细胞本身的生长特性，环境也会影响细胞的状态：细胞生长的附着物或支持物性质（如：细胞培养瓶/板或细胞培养载体）；细胞培养基的理化性质和成分；气相成分；培养温度等。合适的培养环境才可以使细胞表现出特定的功能。
无论是原代培养还是细胞系的传代培养，都要定期更换培养基。而传代培养过程中，细胞通常遵循一种标准的方式生长：接种后经过一段潜伏期进入指数生长期，即对数期，在这一阶段细胞的生长状态最好。此后细胞密度将逐渐增加到铺满整个细胞培养板/皿/瓶有效基质，当细胞浓度超出培养基的能力时，细胞生长速度将大大减慢，这时可以选择更换培养液或进行分瓶培养，也就是传代。悬浮细胞培养由于机械力保持细胞在悬浮状态，培养和传代过程也不需要胰蛋白酶消化，但是无论哪种情况，都有相似的生长周期。
#3
专家意见： It is unclear what are the characteristics of the cells used. Are they cell lines, immortalized cells, a primary culture? Please clarify.
译文： 目前还不清楚所使用的细胞有什么特点。它们是细胞系、永生化细胞还是原始培养物？
编辑解读： 细胞永生化是指细胞在体外培养的过程中，由于自身基因变化或者是外界各种刺激条件，避免的正常传代细胞衰老死亡的过程，以至于可以长期传代培养、无限分裂增殖。
细胞永生化的意义： （1）能获得大量的细胞资源，改善细胞传代少、增殖慢的困境，使细胞可以无限传代，并且永生化的细胞生长更强劲，节省了实验周期。（2）可以帮助研究者熟悉掌握细胞增殖与衰老死亡的的生理过程。（3）是体外研究肿瘤细胞各个阶段的的良好模型，为癌症治疗、抑制癌症细胞增殖等提供新的研究方向。（4）在遗传上属于同一种群，能够建立相同遗传性状的细胞库，有助于实验结果的稳定性。 表1：常用的永生化细胞系
细胞永生化的方法：
细胞永生化一般有两种分子机制：外源病毒蛋白抑制或者自身突变导致原癌基因活化或抑癌基因失活，使细胞绕过正常细胞的周期检查点，细胞衰老死亡途径受阻，达到无限增殖的目的；另一种是激活端粒酶使端粒长度延长，可以持续增殖；具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳头状瘤病毒HPV等。细胞永生化有不同的方法，不同的方法适用于不同的组织细胞。如HPV可介导人的上皮细胞如口腔上皮细胞、表皮细胞、角化上皮等的上皮细胞永生化；猿猴病毒的SV40 大T抗原（TAg）用于黏附细胞、成纤维细胞、内皮细胞等、EBV用于淋巴母细胞样细胞；端粒酶TERT则用于间充质干细胞和其他一些细胞。
#4
专家意见： It is necessary to clearly describe the surface where the cells were plated and cultured. Was it ploystyrene? Was an adherent surface? Was it coated to further improve Schwann cell attachment? Please, clarify.
译文： 有必要清楚地描述细胞培养板的表面。是聚苯乙烯吗？是粘附表面吗？是否有涂层以进一步改善许旺细胞的附着？请明确说明。
编辑解读： 大部分动物细胞需要贴附在一个固相界面上才能生长。而一般只有亲水的固相界面，细胞才能贴附。聚苯乙烯透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性，成为一次性细胞培养皿和培养板等一次性细胞培养耗材的首选材料（一般的磁带和CD盒也是用聚苯乙烯制成的）。然而聚苯乙烯表面是憎水的，所以需要经过表面的改性处理，变成亲水后才能适用于细胞培养。一次性细胞培养皿等标明“Tissue culture treated”，是表示该器皿经过表面的改性处理，适合贴壁细胞的培养。而悬浮生长的细胞，就不一定需要这样经过特殊处理过的器皿。但经过表面的改性处理后的细胞培养皿等一般也适合悬浮细胞的培养。
参考资料：
柳伟伟，胡良平，贾元杰，等.实验设计中的重复原则.药学服务与研究，2010.
https://zhuanlan.zhihu.com/p/26147648
https://zhuanlan.zhihu.com/p/425860561
https://zhuanlan.zhihu.com/p/641619983