Tau抗体嵌合会改变其电荷和结合，从而降低其细胞摄取和功效
前言：
Tau抗体是一种用于研究和检测Tau蛋白的抗体，我们发现tau抗体的神经元摄取及其功效在很大程度上取决于抗体电荷，此外，它们预防tau毒性和tau病理播种的能力不一定同时存在。
特别是，4E6的嵌合化将其电荷从6.5增加到9.6，这阻止了其被人细胞和小鼠细胞吸收，此外，与小鼠抗体相比，尽管结合位点完整，h4E6仍改变了结合特性，摄取和结合的这些变化大大降低了其预防tau毒性的功效，尽管在某些条件下它确实阻止了tau的病理播种。
抗体
Tau单克隆抗体4E6，1B9和2C11由我们的实验室使用GenScript公司的服务产生野生型BALB / c小鼠用对应于以下磷酸表位的肽免疫：cTDHGAEIVYK（pS）PVVSGDT（pS）PRHL（4E6-p396 / 404）;cPGSRSR（pT）P（pS）LP （1B9-p212/214）;IG（pS）TENLKHQPGc （2C11-p262）。
肽通过半胱氨酸残基偶联到锁孔帽贝血蓝蛋白中。从对免疫反应充分反应的小鼠制备杂交瘤，并用蛋白A亲和柱的低内毒素版本纯化抗体。测试抗体与靶表位结合，组织染色和免疫印迹（1B2和1C9参见补充图2和11，4E6表征见[7，8，12]）。
市售抗体用于免疫印迹和免疫细胞化学实验。NeuN（RRID：AB_10807945），Pan-tau（RRID：AB_10013724）和pSer199多克隆一抗购自Millipore，Dako和ThermoFisher。
4E6人嵌合单克隆抗体的表达和纯化
小鼠mAb 4E6通过GenScript测序，并将4E6重链和轻链的可变结构域克隆到含有人IgG的pVRC8400哺乳动物表达载体中1常量域。
将含有重链和轻链的质粒瞬时共转染到含有293%PenStrep的DMEM培养基中的5F细胞中。表达5天后，通过离心和0.22μm过滤澄清上清液。
使用蛋白A亲和色谱的低内毒素版本分离嵌合4E6，并用体积排阻色谱进一步纯化。我们最近报道了这种人嵌合抗体的晶体结构。
原代神经元培养
如前所述，从第1天JNPL3幼崽的皮质和海马体制备神经元培养物[7，8]。所有缓冲液和培养基组件均购自英维特罗根。
简而言之，在用胰蛋白酶在20°C孵育37分钟之前，在缓冲液中洗涤组织。 然后在机械解离之前对组织进行进一步洗涤。将样品轻轻离心以去除碎屑，并添加到含有电镀介质的孔中。24小时后，电镀介质被神经基础培养基取代。然后让培养物在用于实验前恢复7天。
免疫印迹
蛋白质印迹按描述进行[7]。将细胞在250μlRIPA缓冲液中裂解，测定总蛋白浓度，并相应地归一化。在每种实验条件下，用同一动物制备的未处理对照样品在同一凝胶上运行，以作为内部对照。
将所有样品加入O+上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl （pH 6.8）、5%甘油、5%β-巯基乙醇、2.3%SDS、1mM EDTA、1mM乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、1mM PMSF、1mM NaF、1mM Na3VO4和1μg/ ml完全蛋白酶*制剂抑**混合物（罗氏应用科学））并煮沸5分钟。
细胞裂解物在12%聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜上。为了进行抗体表征，用1B9和2C11在Superblock（Invitrogen）中以1：1000稀释度在4°C下过夜探测印迹。 在室温下以1：5000稀释度使用HRP偶联的小鼠次级1小时。
用针对神经元标志物NeuN的兔抗体，总tau（Dako）和tau在Ser199（Invitrogen）上以1：1000稀释度在SuperBlock（Invitrogen）中在4°C下过夜，探测PHF和mAb实验中的印迹。 每个实验都是使用由同一动物制备的细胞进行的，以限制变异性。
将膜在HRP偶联的兔二抗（1：5000）中在室温下孵育1h。在所有实验中，使用富士LAS-4000可视化化学发光信号，并用Multigauge（RRID：SCR_014299）进行量化。
当探测细胞内4E6，cat4E6，1B9，2C11或Tau-5的水平时，如上所述运行并封闭印迹。之后，将它们在1：1000稀释的HRP偶联小鼠二抗中孵育过夜。然后洗涤和显影印迹，无需进一步添加抗体。
斑点印迹
为了比较小鼠二抗与4E6，1B9，2C11和Tau-5的结合，将等分试样以200mg / ml点样到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭在TBS-T中的5%牛奶中，并在1：5000稀释的HRP偶联小鼠二抗（ThermoFisher）中孵育过夜。
在TBS-T中洗涤印迹，并使用富士LAS-4000显影。为了比较4E6和cat4E6，或4E6和h4E6之间的比较，将抗体的连续稀释液点样到膜上（1mg / ml，0.25mg / ml，0.062mg / ml）。然后将膜封闭并酌情与HRP偶联小鼠（ThermoFisher）或人（Abcam）辅助孵育。
所有免疫印迹和ELISA实验均使用相同的二抗。4E6和h4E6的印迹膜与不同的二抗一起孵育，但一起洗涤和显影，以尽量减少处理过程中的任何差异。
免疫组织化学
将额外的神经元培养物铺在玻璃盖玻片上以进行摄取实验。将细胞固定在高碘酸赖氨酸多聚甲醛（PLP）中，并用总tau抗体染色。
使用两种荧光标记的二抗，兔多克隆检测总tau，单克隆小鼠检测4E6，1B9，2C11和Tau-5。使用尼康Eclipse Ti共聚焦显微镜在40倍放大镜下对盖玻片进行成像。
对于抗体表征实验，使用先前描述的方法对AD脑组织进行1B9和2C11染色[58]。石蜡嵌入部分安装在明胶涂层载玻片上。为了去除石蜡并暴露表位，将载玻片浸入二甲苯中，然后使用一系列乙醇浓度降低的溶液。
将载玻片在柠檬酸缓冲液（10mM柠檬酸，0.05%吐温20）中煮沸，并与80%甲酸一起孵育。然后将载玻片封闭并与一抗（1：200）在4°C孵育过夜。 之后，将载玻片洗涤并与HRP偶联的小鼠二抗在室温下孵育30小时，并将亲和素-过氧化物酶溶液孵育0分钟。
随后，在2.5000M乙酸钠溶液中洗涤载玻片，然后与二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和硫酸镍铵溶液反应以可视化抗体染色。使用增加浓度的乙醇和二甲苯对样品进行脱水，然后使用DEPEX封片剂盖玻片。使用徕卡DM<> B显微镜收集图像。
活细胞成像
将原代神经元培养物在玻璃底板中生长，并与1μg/ ml标记的未修饰或人嵌合5E4的Cypher 6孵育24小时。Cypher 5标签对酸敏感，在酸性区室（如内体和溶酶体）中发出荧光。使用Axio Observer倒置共聚焦显微镜在20倍放大倍率下收集图像。
如上所述制备神经母细胞瘤细胞，并与20μg/ ml标记的未修饰或人嵌合5E4的Cypher 6孵育3小时。然后使用API DeltaVision个人DV显微镜收集图像。
共聚焦图像定量
将来自4E6，1B9，2C11和Tau-5摄取实验的图像导入图像J（RRID：SCR_003070）中，颜色通道分裂。然后使用共定位查找宏[14，59，60]，计算每个图像中在两个通道（总tau和抗体）中都有信号的像素百分比。
对于实时成像实验，将每张图片导入图像J。调整阈值直至荧光信号突出显示，并确定每个图像的抗体信号占据的像素面积百分比。该方法用于原代神经元和神经母细胞瘤细胞。
等电聚焦
将每种tau抗体的等分试样添加到IEF样品缓冲液中，并按照制造商的说明在预制的3-9 IEF凝胶（BioRad）上运行。电泳后，将凝胶在20%Comassie蓝色溶液（50%甲醇，50%H2O）在室温下。然后将凝胶在50%甲醇，40%H的溶液中脱色2O和10%乙酸，直到条带可见。
酶联免疫法检测
在这些实验中使用了两种不同的ELISA测定程序。首先，将板在冷藏室中包被过夜，每孔1μg靶标（从人脑中分离的tau或tau肽）。对于人tau结合测定，使用了来自可溶性tau和sarkosyl不溶性tau组分以及可溶性PHF的蛋白质。
在其他实验中，将包含含有磷酸化Ser396/404或其非磷酸化版本的c末端区域的肽包被到板上。然后使用Superblock（ThermoFisher）将板封闭30分钟，然后将每种抗体的连续稀释液添加到板上，随后孵育2小时。
在TBS-T中洗涤板，并将二抗（1：5000），小鼠（赛默飞世尔）或人（Abcam）加入板中1小时。进一步洗涤后，使用TMB过氧化物酶（ThermoFisher）开发板，停止使用2M硫酸，并由BioTek Synergy 2板阅读器读取。
对于竞争性ELISA测定，选择单一浓度的抗体，并与增加浓度的可溶PHF孵育30分钟，然后将其添加到测定板中。其余程序与非竞争性ELISA相同。
统计分析
统计分析在GraphPad 7（SCR_002798）中进行。对于所有PHF和抗体实验，将处理过的样品与由同一动物制备的未处理的对照细胞进行比较。双向方差分析用于LDH，NeuN和tau种子实验以及使用Dunnett多重比较检验进行的事后测试。
在比较正常和阳离子化或正常和人类嵌合4E6的摄取时，使用双尾t检验来确定显着性。
由于纳入了多个组，仅在第7天（#）在未处理组和PHF处理组之间进行统计分析，以验证PHF毒性/tau播种，并在单独使用PHF或PHF处理的第7组与单个抗体之间进行统计分析。
结论：
我们实验的一个主要发现是，抗体功效不仅取决于它识别的表位，还取决于抗体电荷，抗体电荷会影响抗体摄取到神经元中，另一个关键发现是，抗体在预防毒性和播种方面的功效不一定齐头并进。
第三个重要发现证实了我们之前的结果，即对聚集tau的强亲和力与疗效无关，所有这些结果对正在进行的tau免疫疗法临床试验以及确定临床候选药物的筛选方法的有效性具有重大意义。
人源化tau抗体在临床试验中的特征尚未得到很好的描述，这些发现引起了人们的主要担忧，即它们的特性可能与小鼠对应物非常不同，这可能会显着改变其功效。