近年来，有关再生障碍性贫血（Aplastic Anemia，AA）中医辨证分型客观化、标准化的研究已有众多报道，不少学者对AA免疫学指标与中医辨证分型的关系进行了较深入的探讨，我们的前期研究中也探讨了AA的中医客观化研究[1-3]。但到目前AA中医辨证分型的客观量化及其与AA免疫学发病机制的相关性分析报道仍不多。我们采用流式细胞技术对24例AA患者及24名健康人外周血的各项预设免疫学指标进行检测，应用统计学判别分析的方法，对众多免疫学指标进行筛选，建立了AA中医辨证分型肾阳虚及肾阴虚的判别方程，对AA中医辨证分型进行客观量化，现报告如下。
资料与方法
1 临床资料
1.1 病例一般资料 全部病例来自2003年5月至2004年1月期间本院血液科病房及门诊就诊的AA患者共24例，年龄16-62岁，其中男13例，女11例；皆为原发病例；初治者6例，复治者18例；病程0-105个月。根据中医辨证，符合肾阴虚型14例，肾阳虚型10例。健康对照24名全部为门诊健康体检者，年龄20-56岁，其中男性12例，女性12例。
1.2 诊断标准 AA的诊断参照1987年全国AA学术会议修订的诊断标准[4]，AA中医辨证肾阳虚及肾阴虚型的诊断参照中国中西医结合血液学专业委员会于1989年在大连会议上修订的AA辨证分型标准：
1.2.1 肾阳虚型 心悸、气短，周身乏力，面色苍白无华，唇色淡，畏寒喜暖，手脚冷凉，腰酸，阳萎，夜尿多，大便稀溏，虚胖或浮肿，多无出血，脉细无力，舌质淡，舌体胖，边有齿痕，舌苔白。
1.2.2 肾阴虚型 心悸,气短,周身乏力,面色苍白无华,唇淡，甲床苍白。伴有低热，手脚心热，盗汗，口渴思饮，大便干结，口腔粘膜、牙龈出血，鼻出血。皮肤有出血点或紫癜，妇女月经量多，脉细数，舌质淡。
2实验方法
2.1 实验试剂及免疫学指标的选取 所用抗体均为小鼠抗人单克隆抗体，FITC、PE、ECD、PE-CY5四色荧光直接标记。其中CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，CD3-FITC/CD19-PE
/CD56-PC5，CD3-FITC/HLA-DR-PE/CD25-PC5，CD3-FITC/CD28-PE/CD8-ECD/CD4-PC5，CD45RA-FITC/CD45RO-PE/CD8-ECD/CD4-PC5，Vα24-FITC/CD161-PE/CD8-ECD/CD4-
PC5，γδT-FITC/CD161-PE/CD8-ECD/CD4-PC5及其相应同型对照，OptiLyse C溶血素均是美国BEKMAN-COULTER公司的产品；PBS：PH7.2，含0.1 %NaN3。
本研究在预选以上单抗组合的基础上，确定了有临床意义的免疫学指标CD3+/CD4+/CD8+、CD3+/CD56+、CD3+/HLA-DR+/CD25+、CD45RA+/RO+/CD4+/CD8+、γδT /CD161+/CD4+/CD8+等及相应的绝对值（´109/L）共53项，进行流式细胞仪检测。
2.2 标本制备与检测
所有患者入组后，在进行辨证分型同时，经静脉穿刺抽取患者外周血2 ml，EDTA抗凝，立即混匀。健康人在入组同时依以上原则取血。用MEK-6318型血细胞分析仪（日本光电）进行外周血淋巴细胞计数。常规方法标记细胞，采用美国Beckman-Coulter公司的EPICS-ELITE流式细胞仪，Flow-Check校准光路，应用四色荧光分析法，采取FSvSS设门，确定淋巴细胞群，分析10,000个细胞/样本，Vα24检测分析50,000个细胞以上，应用EXPO32软件分析结果。
3 统计学处理 本研究采用Fisher判别和Bayes判别分析方法；均数比较用t检验；实验数据以平均数±标准差（X± s）表示；整个统计分析采用SPSS12.0统计软件进行。
结 果
1 AA 中医辨证肾阳虚及肾阴虚型判别方程的建立[1-3]
整个过程应用判别分析方法，经过逐步法筛选，最后选出CD45RA+绝对值、CD3+CD25+绝对值、CD3+CD25+（%）、CD3+HLA-DR+绝对值和CD4+γδT（%）等5个值，它们与AA中医辨证分型关系最为密切，并以这5个值建立了正常对照组及肾阳虚和肾阴虚型的判别方程：
对照组：Y=-6.97–2.706×(CD3+HLA-DR+绝对值)+0.373×[CD3+CD25+(%)]–26.227×(CD3+CD25+绝对值)+9.726×(CD45RA+绝对值) – 0.928×[CD4+γδT(%)]
肾阳虚组：Y=-5.47+17.206×(CD3+HLA-DR+绝对值)+0.245×[CD3+CD25+(%)]–14.139×(CD3+CD25+绝对值)+2.841×(CD45RA+绝对值) + 7.46×[CD4+γδT(%)]
肾阴虚组：Y=-5.134+4.198×(CD3+HLA-DR+绝对值)+0.563×[CD3+CD25+(%)]–30.425×(CD3+CD25+绝对值)+4.241×(CD45RA+绝对值) + 2.899×[CD4+γδT(%)]
2 AA 中医辨证肾阳虚及肾阴虚型的一般状况
严格按照中医四诊的辨证要求进行中医辨证，其与慢性AA（CAA）和重型AA（SAA）的相关性及组中一般状况见表1。
表1 AA中医辨证肾阳虚及肾阴虚型的一般状况
由表1所见，中医辨证为肾阴虚者外周血象偏低，与肾阳虚型相比有显著性差异（P<0.01），临床症状典型（SAA占78.5%，CAA占21.5%），病情相对较重，而中医辨证为肾阳虚型者临床症状不突出（SAA占20%，CAA占80%），病情相对较轻。
3 AA 中医辨证肾阳虚及肾阴虚型免疫功能变化
以正常对照组作为参照，AA中医辨证肾阳虚及肾阴虚型的免疫功能变化见表2：
由表2所示，与正常对照相比，AA的中医辨证肾阳虚型的CD3+CD28+绝对值、肾阴虚型的CD3—CD19+、CD3+HLA-DR+、CD3+CD28+和gdT绝对值均显著下降（P<0.05，P<0.01），CD3+（%）和CD3+CD28+（%）显著上升（P<0.01）。
与肾阳虚型相比，AA的肾阴虚型的CD3—CD19+、CD3+HLA-DR+、CD3+CD28+和gdT绝对值显著下降（P<0.05），CD3+（%）和CD3+CD28+（%）显著上升（P<0.05）。
讨 论
AA在中医学属于“虚劳”、“血虚”、“虚劳亡血”的范畴。肾虚是导致气血不足、生血障碍的根本原因，并贯穿于AA的始终。肾精亏损，不能滋生血液，致血枯髓空，是AA发病的病因病机。故七十年代以来，AA以肾虚立论进行辨证治疗，结合现代医学的治疗成果，使中西医结合治疗AA获得令人满意的疗效。辨证论治是中医学的精髓，证是机体功能状态的综合反应，是辨证论治的核心。中医证型客观化研究是中医现化化研究中的重要组成部分，也是目前科学研究的难点和热点之一。已有不少学者从多角度对AA辨证分型进行了客观化的探讨，我们也对此进行了相关研究[1-3]。
AA的发病机理尚未完全阐明，大量的研究证实，免疫介导的造血抑制是AA常见的病理机制，与异常免疫有关的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活化和增殖是引起AA造血功能衰竭的重要原因[5-6]。CD25、HLA-DR分别是T细胞激活的早期和晚期标志[7]。CD28是T细胞主要的共刺激分子受体，CD28与B7分子的结合为T细胞活化提供重要的第二信号，来自第二信号的缺乏将导致免疫无能[8]。CD45RA/RO分别在初始T和记忆T细胞优势表达，已有报道指出CD45RA/RO在系统性红斑狼疮活动期、多发性硬化症及银屑病等免疫性疾病患者中表达显著增高[9]，其比例变化反映出体内免疫系统活化的程度。γδT细胞是大颗粒淋巴细胞，具有很强的NK样细胞毒功能，其作用机制与NK、CTL等细胞相似，活化的γδT细胞还分泌IL-2、IL-6、 IFN- γ等细胞因子而影响造血[10]。总之，AA患者免疫功能异常，AA患者中呈活化状态的CD25+及HLA-DR+ T细胞增多，分泌造血抑制因子，通过直接的细胞毒作用或通过其分泌的抑制因子而抑制造血，最终导致造血功能衰竭，可能是AA免疫病理机制的生物学基础。
本研究首先辨证确定AA患者的中医分型（肾阳虚和肾阴虚），再利用统计学方法筛选出CD45RA+绝对值、CD3+CD25+绝对值、CD3+CD25+（%）、CD3+HLA-DR+绝对值和CD4+γδT等5个免疫学指标，建立了AA中医辨证肾阳虚和肾阴虚型的判别方程，对中医证型从免疫学角度进行量化，使临床辨证更具客观性、准确性和可操作性。研究中对肾阳虚型和肾阴虚型的一般状况进行分析比较，证明肾阴虚型患者临床表现较重，肾阳虚型较轻。此二型的免疫功能的比较研究进一步证实，肾阴虚型与肾阳虚相比，免疫学指标的变化更显著，提示患者体内免疫功能紊乱程度更重，这不但进一步证明AA具有免疫学的发病机制，也提示中医辨证分型能够体现AA的本质特征，说明把AA进行中医辨证，分为肾阴虚和肾阳虚型确有其客观物质基础，从而可以指导临床治疗，提高临床疗效。另外，因肾阴阳两虚型的某些症候在临床实践中较难把握，受主观影响比较大，本研究病例数较少，本次未能进行观察讨论，我们将在下一步扩大病例数的基础上进行分析总结。
本研究应用判别分析方法筛选出5个免疫学指标，建立了AA中医辨证肾阳虚和肾阴虚型判别方程，使AA辨证分型得以客观量化，具有临床实际意义；分析了肾阳虚和肾阴虚型患者的一般临床特点，证明肾阴虚型患者临床表现较重；观察并比较了肾阳虚和肾阴虚型患者的免疫功能状态，发现肾阴虚型患者免疫紊乱程度较重，这就为AA中医辨证分型找到了客观依据和物质基础。这也从一定程度上为AA的免疫学发病机制提供了中医临床辨证证据的支持，同时也反映出中医辨证与AA免疫学发病机制的内在联系。
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唐旭东简介：中医药传承博士后，中西医结合临床专业博士学位，中国中医科学院西苑医院血液科副主任医师，合作导师麻柔主任医师。主要研究放向:再生障碍性贫血，骨髓增生异常综合征，血小板减少症；白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤等恶性肿瘤化疗的中药解毒增效治疗。
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